2016 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a superior assay for activated platelet-derived microparticles by ELISA and elucidation of a mechanism of hypercoagulability.
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26460679
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
岡野 こずえ 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50160693)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野島 順三 山口大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30448071)
丸田 雄一 山口大学, 医学部, 特別医学研究員 (30543970)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 活性化血小板 / マイクロパーティクル / 抗AnnexinV抗体 / 血小板特異的抗体 / ELISA法 / 採血条件 / 不整脈 / 抗凝固薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マイクロパーティクル(MP)は、細胞が活性化した際などに放出される1.0μm未満の膜小胞体であり、特に活性化血小板MP(aPLT-MP)は、強力な凝固活性促進や炎症促進作用などを有している。aPLT-MP定量を目的として、活性化マーカーのホスファチジルセリンに対する抗体と血小板特異的抗体を組み合わせたaPLT-MP ELISA法の開発を行った。また、健常人および患者検体を測定し、aPLT-MPの血栓形成促進作用の解明を試みた。
試料には、健常人13例と心房細動72例、高血圧60例、糖尿病41例の患者検体のクエン酸Na血漿を用いた。測定は、採血後15分以内に1200g 10分で遠心分離した血漿を用いた。
aPLT-MP ELISA法は、4種の一次抗体と8種の二次抗体の組み合わせ、および反応条件等を検討し作成した。健常人PRPの血小板数を20万個/μLに調整し、刺激剤ADPで37℃下にて170g 10分間攪拌後、凍結、超音波処理をして標準液とした。採血は21G採血針、真空採血管の2本採血を基本とし、採血管4種類、フラッシュバック有り無し採血針2種類について、aPLT-MP測定値への影響を検討した。特異性は、赤血球、単球、血管内皮、白血病細胞株MPを作製し評価した。
一次抗体に抗AnnexinV抗体、二次抗体に抗GPⅠｂ抗体の組み合わせが最も感度、特異性、再現性良くaPLT-MPを捉えた。検量線は、aPLT-MP濃度と吸光度において直線性が得られた。採血条件では、4種の採血管間、フラッシュバック有り無し採血針間で有意な差は見られなかった。健常人検体のaPLT-MP値は13.1±3.18/μL (n=13)、患者検体のaPLT-MP値は12.4±6.54/μL (n=178)で有意差は見られなかったが、aPLT-MPへ影響を与える因子として不整脈と抗凝固薬が選出された。
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