2014 Fiscal Year Research-status Report
痒み神経機構の生後発達におけるドーパミン神経系の役割解明
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26460705
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| Research Institution | Kitasato University |
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Principal Investigator |
緒形 雅則 北里大学, 医療衛生学部, 講師 (20194425)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
石橋 仁 北里大学, 医療衛生学部, 教授 (50311874)
歌 大介 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (70598416)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 幼若期ドーパミン神経系傷害 / 痒覚 / 行動実験 / c-Fos |
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| Outline of Annual Research Achievements |
生後4日目の雄ラットの両側側脳室に6-hydroxydopamineを注入することにより幼若期ドーパミン(DA)神経傷害動物を作製し、痒覚神経機構の発達におよぼすDA神経系の役割を行動学的解析と免疫組織化学染色により調べた。
痒み誘発物質であるセロトニン(5-HT)の右後肢足底への注入による痒み関連行動の出現と、脊髄内c-Fos陽性細胞の発現を解析した。またc-Fosは神経細胞の興奮マーカーとして用いた。研究実施計画に従い1％ 5-HT投与実験から始めた。その結果、幼若期DA神経傷害にともなう成熟後の痒覚関連行動の顕著な減少が観察された。一方、1％ 5-HT投与により痛み関連行動と類似した行動も観察され、この行動の幼若期DA神経系傷害による有意な増加が観察された。幼若期DA神経系傷害が炎症性痛覚過敏を誘発することから、他研究機関でも用いられている低濃度の0.05％ 5-HTを用いて次の実験を行った。その結果、1％ 5-HT実験と同様に幼若期DA神経系傷害により痒み関連行動の有意な減少が観察され、痛み関連行動に類似した行動には影響はみられなかった。
1％ 5-HT投与による脊髄内c-Fos陽性細胞は、対照群、幼若期DA神経系傷害群ともに脊髄表層に多く観察された。またc-Fos陽性細胞数には幼若期DA神経系傷害にともなう影響は認められなかった。これらのことは、幼若期DA神経系傷害による痒み関連行動の減少に脊髄よりも上位の神経系の変調が関与していることを示唆している。また痛覚系とは異なる影響が痒覚系で観察されたことは、これら2つの感覚系が別々に発達・存在していることを示唆している。
パッチクランプ法による電気生理学的実験では、分離細胞に対するシステムの構築と安定した記録が、そしてインビボパッチクランプ法でも実験環境の構築がほぼ終了した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
交付申請書に記載したごとく、痒み関連行動を複数濃度の5-HTで実施する予定であったが、今年度は1％ 5-HTと0.05％ 5-HTの2種類での検討になった。本原因として、H26年7月末に実験動物供給業者から購入した動物の細菌感染が報告され、DA神経系傷害処置後の動物を感染拡大防止のために処分したこと、その後、しばらく実験動物の安定した供給が得られなかったことが挙げられる。今後、さらに異なる濃度の5-HTを用いて幼若期DA神経系傷害の痒覚関連行動への影響を明確にするとともに、脊髄内におけるc-Fos陽性細胞の分布や発現数を詳細に検討していく予定である
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| Strategy for Future Research Activity |
H27年度：初めに行動実験から着手する。具体的には5-HT濃度を0.1％としH26年度に得られた行動解析の結果と比較する。また必要に応じて0.01％あるいは2％ 5-HT投与実験を追加する。免疫組織化学解析に関しては脊髄におけるc-Fosの発現を行動実験の結果と比較しながら解析を進めていく。さらに脊髄よりも上位の領域にでのc-Fos発現の相違に対しても研究を行う。また結果の信頼性向上のため、後肢へのVehicle(生理食塩水)注入実験も加える。その後、幼若期DA神経系傷害によるc-Fos発現への影響が認められた部位を中心に5-HT神経系、ノルアドレナリン神経系等の関連蛋白質に対する抗体とc-Fosとの二重染色を行う。また逆行性神経トレーサーの注入実験も行い、痒覚神経機構の発達異常の背景を明らかにする。
スライスパッチクランプ法による電気生理学的解析では、脊髄の後根付きスライス標本を用いて脊髄表層への興奮性入出力をpaired-pulse ratioやAMPA受容体Ca2+透過性などを指標に調べる。尚、実験の効率を良くするために、電気生理学解析は行動、組織学的解析が十分進んでから開始する。
H28年度：組織学的解析では、新たにミクログリアの活性化に対する免疫染色を開始する。ミクログリアの活性化がみられる中枢神経内の領域とその時期を検討するため、6-OHDA処置後2週目、4週目、6週目の標本に対して実験を行う。スライスパッチクランプ法による電気生理学的解析では、前年度の不足分を補充するとともに抑制系への影響も検討する。インビボパッチクランプ法では、脊髄よりインビボパッチクランプを行い、行動実験で得られた5-HT濃度条件をもとに5-HTを後肢へ注入し発生する興奮性入力を記録する。また痛み刺激や触刺激を与え刺激のモダリティとDA神経系傷害との関連を明確する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用助成金が発生した理由として、以下の2点が挙げられる。
①H26年7月末に実験動物業者から購入した動物の細菌感染が報告され、モデル動物を感染拡大防止のために処分した。このことにより実験数は予定より減少し、結果として消耗品全体の使用量が少なくなったため。
②研究代表者と研究分担者との打ち合わせを予定していたが、両者の学会発表の日程上の都合により、本年7月に変更になったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度研究費の使用計画に記載したごとく、H27年度の予定として、物品費は抗体関連、組織学的解析関連試薬に費やす助成金の割合が高い。旅費は北米神経科学会あるいはアジアオセアニア生理学会での発表に使用する予定である。これらに関しては次年度の申請助成金からの支出する予定である。一方、今回生じた次年度使用助成金は、上記のごとく、延期となった研究分担者との研究打ち合わせ用の旅費と実験数の追加が必要な行動実験に使われる物品購入に充てる予定である。
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Research Products
(1 results)
