DNAのシリカ結合能とシリカ結合性蛋白を利用した珪藻検出法

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26460882
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 瀬尾 泰久 大分大学, 医学部, 助教 (80187830)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 岸田 哲子 大分大学, 医学部, 教授 (50136793) ; 内田 智久 大分大学, 医学部, 助教 (70381035)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 溺死 / プランクトン / 珪藻 / 染色 / ストレプトアビジン

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、ストレプトアビジンを使った珪藻被殻の染色法について検討した。まず、ガラスビーズやプラスチックビーズ、スライドグラス等に対するペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンの吸着性について検討した。その結果、ストレプトアビジンは、ガラス質に対してのみ強い吸着能を有しているのではなく、全体の約0.5%程度がmultipleな非特異的吸着性を有しているのではなかろうかと推測された。そこで、市販のペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン数種類を用いて吸着性の違いを比較検討したところ、各メーカーによって吸着量や染色性に違いがあることが明らかとなった。
次いで、これらの性質を利用した珪藻被殻の染色法を開発した。クリーニング処理した珪藻被殻を含む標準液に、1／25量の0.01 mg/ml BSAを添加後、カバーグラスにマウントし90℃のホットプレート上で完全に乾燥した。その後、ホットプレートを200℃に加温し、30分間加熱固定した。次いで、ミリＱ水で0.01 mg/mlに調整した非標識のストレプトアビジンをマウントし、室温で15分間ブロッキングした。ミリＱ水で軽く洗浄後、1％ Tween 20を含むミリＱ水で800倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンをマウントし、室温で15-60分間インキュベーションした。洗浄後、免疫組織化学用の基質を用いて室温で15 分間発色した。水洗によって反応を停止後、水系封入乳剤で封入し、スライドグラス上に標本を作製した。作製した標本は顕微鏡下で観察し、必要に応じて写真撮影を行った。
その結果、珪藻被殻の輪郭が鮮明に染色されているばかりでなく、内部構造に至るまで良好なコントラストを示す染色像が認められた。しかし、珪藻のみが特異的に染色されているわけではなく、その他の夾雑物も同時に染色される例が多くみられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初、アミノ化したPCR フラグメントをマイクロタイタープレト上に固相化し、珪藻被殻をビオチン標識PCR フラグメントとペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを使ってサンドイッチ後、ペルオキシダーゼ染色する方法について検討を行った。その結果、珪藻被殻が染色可能であることを実証し、報告した。しかしながら、本法は、実用化、汎用化に向け未だ解決できていない問題点が多く存在するばかりでなく、カオトロピック剤という強力な変性条件下での反応を強いられるため、実際に染色に至るまでの手順が煩雑であった。
ところで、このPCRフラグメントを利用した珪藻染色法の研究に際し、本来珪藻に結合したビオチン標識PCR フラグメントと２次反応で結合すべきペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンが、ビオチン標識PCR フラグメントを介さずに直接珪藻被殻へ吸着しているのではないかとの疑問を持つに至った。
そこで、ストレプトアビジンのガラス質への吸着性を証明し、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを使った珪藻被殻の染色法の開発に着手した。本法が完成すると、染色時間も大幅に短縮されたるばかりでなく、コスト的にも前述のPCRフラグメントを利用した珪藻染色法に比べ大幅に改善すると期待される。

Strategy for Future Research Activity

各メーカーによりストレプトアビジンの非特異的吸着性に違いが認められることから、珪藻被殻の染色に最も適した標識ストレプトアビジンの検索を行う予定である。また、標識酵素や発色基質についても様々なものを検討の対象にする。
また、ストレプトアビジンの非特異的吸着性は、希釈溶媒のpHに依存する傾向が認められるようであるので、様々な条件下で比較検討を行い、最も簡便で、再現性の高い染色法の完成を目指す。

Causes of Carryover

本年度は、ストレプトアビジンの非特異的吸着性が明らかになったため、主にペルオキシダーゼ標識した市販のストレプトアビジンを使った染色法に注力した。そのために、少額の経費で研究を遂行することが可能であった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

今年度は、ストレプトアビジンの非特異的吸着性の本質を解明し、より簡便で精度の高い染色法について検討する予定である。また、大腸菌や緑膿菌に含まれるシリカ結合性たんぱくを使った染色法についても検討を加える予定である。

Research Products

• [Presentation] 珪藻の染色法-第2報- (2014)
  • Author(s): 青木泰佑、岸田哲子、瀬尾泰久、黒木浩二
  • Organizer: 日本法医学会九州地方会
  • Place of Presentation: 鹿児島県市町村自治会館（鹿児島）
  • Year and Date: 2014-10-10 – 2014-10-11