気管支喘息発作時の気道炎症増悪における獲得免疫と自然免疫のクロストークの解明

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461186
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 藤澤 朋幸 浜松医科大学, 医学部, 助教 (20402357)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 須田 隆文 浜松医科大学, 医学部, 教授 (30291397)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 気道炎症 / 気管支喘息 / Toll-like receptor / IL-17 / polyI:C

Outline of Annual Research Achievements

正常ヒト気管上皮初代培養細胞（Normal human bronchial epithelial cell: NHBE）と正常ヒト気管上皮cell line（HBE1）を用いて、TLRリガンドで刺激した後にmRNAを抽出して，気道炎症促進にかかわる遺伝子群の発現変化を網羅的に解析した。PolyI:C (TLR3リガンド)、LPS（TLR4リガンド）、flagellin（TLR5リガンド）は、気道上皮細胞における種々の炎症性サイトカイン・ケモカイン（IL-8, G-CSF, CXCL-1, IL-1F9）発現を増加させた。
次に、気管支喘息病態形成への関与が報告されているTh2サイトカイン（IL-4, 13）やTh17サイトカイン（IL-17A）の添加が，気道上皮細胞における気道炎症関連遺伝子発現を誘導するか否か検討した。IL-17Aは、気道上皮におけるIL-8, G-CSF, CXCL-1, IL-1F9発現を誘導したが、IL-4, 13 はいずれの発現誘導も来さなかった。
さらに、各種サイトカイン（IL-4, 13, 17A）とTLRリガンドの共添加を行い，気道炎症関連遺伝子群が相乗的に誘導されるか否か，real-time PCR 法を用いて検討した。IL-17AとpolyI:Cの共刺激により、IL-8, G-CSF, CXCL-1, IL-1F9 mRNAの相乗的な発現誘導が認められ、その発現は24時間まで刺激時間依存的に増加した。蛋白レベルにおける発現に関してELISAを用いて検討し、IL-17A/polyI:Cの共添加（24時間）はpolyI:C単独添加と比較して、培養上清におけるIL-8, G-CSF蛋白濃度を相乗的に増加させた。現在、相乗的発現誘導に関わる細胞内メカニズムについて、解析を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究は，「気管支喘息発作時の気道炎症増悪をもたらす気道上皮における獲得免疫と自然免疫の相互作用を解明し効果的な気道炎症抑制法を開発すること」を目的としている。平成26年度の研究成果により、TLR3の活性化（polyI:C刺激）は気道上皮における炎症性サイトカイン・ケモカイン発現を誘導すること、さらにIL-17AとpolyI:Cの共添加は炎症性サイトカイン・ケモカイン発現を相乗的に増加させることが確認された。この結果は、Th17獲得免疫存在下において、ウイルス感染は気道上皮における炎症性サイトカイン発現を相乗的に誘導し、より強力な気道炎症を惹起することを示した極めて興味深い知見であると考えられる。
今後は、気管支喘息におけるウイルス感染時の気道炎症増悪機序の解析を念頭に、IL-17A/polyI:C共刺激による相乗的炎症関連遺伝子発現誘導に関わるシグナル伝達経路や転写メカニズムを解析し、その抑制法の開発につなげるべく研究を発展させる予定である。

Strategy for Future Research Activity

前述の如く、今後はIL-17A/polyI:C共刺激による相乗的炎症関連遺伝子発現誘導に関わる細胞内シグナル伝達や転写メカニズムを解析し、その効果的な抑制法を検討する予定である。重症気管支喘息では、気道あるいは血清中におけるIL-17Aの増加が報告されている。よって、上記メカニズムの解析は、気管支喘息におけるウイルス感染時に伴う気道炎症増悪機序を解明するとともにその抑制法の開発に通じることが期待される。
具体的には、細胞内シグナル伝達や転写メカニズムの解析として、IL-17シグナルやTLRシグナルへの関与が報告されている、TLR3/TRIF/NF-κB経路、MAPK経路、IFR経路などに着目して、それらの活性化の程度をwestern blotting法を用いて、単独刺激時（IL-17A or polyI:C）と共刺激時（IL-17A + polyI:C）において比較検討する。また、クロマチン免疫沈降法を用いて、炎症性サイトカイン・ケモカイン（IL-8, G-CSF, CXCL-1など）遺伝子のプロモーター領域における各種転写因子（NF-κB, IRF）の結合について、単独刺激時（IL-17A or polyI:C）と共刺激時（IL-17A + polyI:C）の相違を検討する。
さらに、各種経路に関してsiRNAを用いたノックダウン（TRIF siRNA, p65 siRNA, IRF3 siRNA）や経路特異的阻害剤（U0126 (ERK inhibitor), SB202190 (p38 inhibitor), SP600125 (JNK inhibitor), BAY11(NF-κB inhibitor)）などを用いて経路特異的阻害を行い、IL-17A/polyI:C共刺激による炎症関連遺伝子群（IL-8, G-CSF, CXCL-1など）の相乗的発現に対していかなる経路阻害が効率よくそれらを抑制しうるか、real-time PCRを用いて解析する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Treatment of acute exacerbation of idiopathic pulmonary fibrosis with direct hemoperfusion using a polymyxin B-immobilized fiber column improves survival (2015)
  • Author(s): Enomoto N, Mikamo M, Oyama Y, Kono M, Hashimoto D, Fujisawa T, Inui N, Nakamura Y, Yasuda H, Kato A, Mimuro S, Doi M, Sato S, Suda T.
  • Journal Title: BMC Pulm Med Volume: 15 Pages: -
  • DOI: 10.1186/s12890-015-0004-4.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Prognostic Significance of Anti-Aminoacyl-tRNA Synthetase Antibodies in Polymyositis/Dermatomyositis-Associated Interstitial Lung Disease: A Retrospective Case Control Study. (2014)
  • Author(s): Hozumi H, Enomoto N, Kono M, Fujisawa T, Inui N, Nakamura Y, Sumikawa H, Johkoh T, Nakashima R, Imura Y, Mimori T, Suda T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 10 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0120313. eCollection 2015.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Plasma connective tissue growth factor levels as potential biomarkers of airway obstruction in patients with asthma. (2014)
  • Author(s): Kato M, Fujisawa T, Hashimoto D, Kono M, Enomoto N, Nakamura Y, Inui N, Hamada E, Miyazaki O, Kurashita S, Maekawa M, Suda T
  • Journal Title: Ann Allergy Asthma Immunol Volume: 113 Pages: 295-300
  • DOI: 10.1016/j.anai.2014.05.026.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prognostic Factors for Myositis-Associated Interstitial Lung Disease. (2014)
  • Author(s): Fujisawa T, Hozumi H, Kono M, Enomoto N, Hashimoto D, Nakamura Y, Inui N, Yokomura K, Koshimizu N, Toyoshima M, Shirai T, Yasuda K, Hayakawa H, Suda T.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 9 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0098824. eCollection 2014.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Quantitative analysis of lung elastic fibers in idiopathic pleuroparenchymal fibroelastosis (IPPFE): comparison of clinical, radiological, and pathological findings with those of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) (2014)
  • Author(s): Enomoto N, Kusagaya H, Oyama Y, Kono M, Kaida Y, Kuroishi S, Hashimoto D, Fujisawa T, Yokomura K, Inui N, Nakamura Y, Suda T
  • Journal Title: BMC Pulm Med Volume: 28 Pages: -
  • DOI: 10.1186/1471-2466-14-91.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Usual interstitial pneumonia preceding collagen vascular disease: a retrospective case control study of patients initially diagnosed with idiopathic pulmonary fibrosis. (2014)
  • Author(s): Kono M, Nakamura Y, Enomoto N, Hashimoto D, Fujisawa T, Inui N, Maekawa M, Suda T, Colby TV, Chida K.
  • Journal Title: PLoS One Volume: 9 Pages: -
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0094775. eCollection 2014.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Clinical features and prognostic factors of myositis-associated interstitial lung diseases. (2014)
  • Author(s): Fujisawa T, Hozumi H , Kono M, Enomoto N, Hashimoto D,NakamuraY, Inui N , YokomuraK, Koshimizu N, Toyoshima M,Shirai T, Yasuda K, Hayakawa H, Suda T.
  • Organizer: American Thoracic Society
  • Place of Presentation: San Diego
  • Year and Date: 2014-05-18 – 2014-05-21
• [Presentation] 多発性筋炎/皮膚筋炎に合併する間質性肺疾患における予後規定因子の解析 (2014)
  • Author(s): 藤澤朋幸，穂積宏尚、河野雅人、榎本紀之，橋本大，乾直輝，中村祐太郎，横村光司，小清水直樹，豊嶋幹生，白井敏博，山田孝，安田和雅，早川啓史，須田隆文
  • Organizer: 日本呼吸器学会総会
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2014-04-25 – 2014-04-27