2015 Fiscal Year Research-status Report
酸化ストレスによる蛋白傷害に対する異性体アミノ酸修復酵素の防御的役割の解析
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26461194
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| Research Institution | Iwate Medical University |
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Principal Investigator |
山内 広平 岩手医科大学, 医学部, 教授 (20200579)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小笠原 正人 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (00325367)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | D-体アスパラギン酸残基 / ミトコンドリア / COPD / PCMT1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
慢性閉塞性肺疾患（COPD）の発症過程における酸化ストレスの障害の１つとして蛋白質中のアスパラギンおよびアスパラギン酸残基の異性体化が起こり、蛋白質の構造変化、その機能障害が起こり、その修復過程をPCMT1酵素が制御しているが、COPD肺組織標本では有意にPCMT1の発現が低下していた。また酸化ストレスによるミトコンドリア障害が指摘され、ヒト肺標本でミトコンドリア蛋白質の中で、形態維持に必要なprohibitin1(PHB1)、内膜の呼吸鎖蛋白質COX IV、および外膜にあるミトコンドリアの酸化還元電位に関わるVDAC蛋白質の発現を検討した。COX IV蛋白質、およびPHB1蛋白質の発現低下とPHB1蛋白質のD-体アスパラギン酸(D-Asp)残基の増加が確認された。一方、VDAC蛋白質の発現低下は認められなかった。そこでこの病態を細胞で確認するため、A549細胞の修復酵素PCMT1遺伝子発現を低下させるとPHB1蛋白質のD-Asp残基の有意な増加を認め、ミトコンドリアのクリステの構造の破壊、呼吸鎖蛋白質であるCOX IV蛋白質発現が低下し、ATPの産生能も低下した。したがってPHB1におけるD-Asp残基の増加はCOPD病態に関与している事が示唆された。しかしながら、PCMT1発現低下で起こる現象はD-Asp残基に留まらず、D-isoAsp, L-isoAsp残基を含む蛋白質も形成され、機能低下だけではなく、病態に積極的に関わる機能獲得の蛋白質として関係することも考えられる。D-isoAsp, L-isoAsp残基を含む蛋白質の存在はこれまでの報告されてきた他の蛋白質のデータから推測できるが、現時点では確認できていない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛋白質中のアスパラギン残基はD-アスパラギン酸残基特異的加水分解酵素paenidase Iを用い、COPD患者由来肺組織、およびコントロール肺組織のpaenidase I 処理と二次元電気泳動により４種類の酵素感受性蛋白質（prohibitin1,peroxiredoxinII,GSTpi,serum amyloid p component）を同定した。その中で活性酸素産生、酸化ストレスと強い因果関係にあるミトコンドリアの内膜に存在するprohibitin1(PHB1)蛋白質に注目し、PCMT1蛋白質、PHB1蛋白質およびCOX IV蛋白質の発現低下とPHB1蛋白質のD-Asp残基含有率がCOPD肺組織で有意な増加を見出した。細胞での病態過程を再現するため研究分担者が樹立した肺胞上皮由来細胞株A549細胞のPCMT1遺伝子ノックダウン細胞株（PCMT1-KD細胞）およびその対象コントロール細胞株（PCMT1-cont細胞）を利用し、PCMT1低下時におけるPHB１蛋白質のD-Asp残基の含有率の増加、ミトコンドリアの形態・機能およびオートファジーについて検討し、ミトコンドリア内膜構造の破壊、COX IV蛋白質の低下、PHB1蛋白質発現の低下を認め、ATP産生能の低下を明らかにした。PCMT1蛋白質はミトコンドリア形態・機能の維持に関与していることを見出した。さらにPCMT1にはendoplasmic reticulum type, cytosol typeの２種類のアイソフォームが存在し、それぞれの発現ベクターを作成し、PCMT1発現低下細胞にさらに遺伝子導入をおこなった。その結果、cytosol typeを導入にした細胞でミトコンドリア形態の回復が認められた。以上これまでの研究経過をまとめると、COPD肺ではPCMT1の蛋白レベルでの発現が有意に低下し、ミトコンドリアの内膜蛋白質PHB1,COX IVの発現も低下していた。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下の2点からなる。
（１）末梢血赤血球のPCMT1の分析
末梢赤血球中にはPCMT1蛋白質が含まれている。赤血球自身に酸化ストレスを受け止める抗酸化機能を持ち、酸化ストレスの痕跡を調べる重要な検体となる。そこでCOPD患者（２０名）、肺機能正常の喫煙患者（２０名）、および非喫煙健康成人（２０名）の末梢血赤血球中のPCMT1の発現量及び活性を測定する。酵素活性はプロメガ社のISOQUANT Isoaspartate Detection Kitを用いて解析する。
（２）PHB1変異蛋白質（Asn⇒Asp）の発現と細胞生物学的解析
PHB1のAsn残基は7か所存在する。それらのAsn残基は酸化ストレスで脱アミノ反応を受けやすく不可逆的非酵素的反応とPCMT1反応により一部D残基に変換される。そこで脱アミノ反応によるAsn⇒Asp置換による酵素活性への影響、および細胞生物学的解析を行う。ミトコンドリアの形態、機能、癒合―分裂応答について検討する。ミトコンドリア形態は電子顕微鏡解析、マイトトラッカーを用いて解析する。機能はATP産生能、ミトコンドリア構成蛋白質の発現を解析する。
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| Causes of Carryover |
試薬が予定より安価に購入できた
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試薬代に含める
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[Journal Article] Lymphangiogenic factors are associated with the severity of hypersensitivity pneumonitis2015
Author(s)
Yamashita M, Mouri T, Niisato M, Nitanai H, Kobayashi H, Ogasawara M, Endo R, Konishi K, Sugai T, Sawai T, Yamauchi K
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Journal Title
BMJ Open Respir Res
Volume: 29
Pages: :e000085
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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