2014 Fiscal Year Research-status Report
CRFニューロン蛍光可視化動物を用いた視床下部局所回路調節メカニズムの解明
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26461372
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
井樋 慶一 東北大学, 情報科学研究科, 教授 (60232427)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
内田 克哉 東北大学, 情報科学研究科, 助教 (40344709)
布施 俊光 東北大学, 情報科学研究科, 助教 (50401039)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ノックインマウス / CRF / 視床下部 / ノルアドレナリン / グルタミン酸 / GABA / 脳 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
相同組換えによりCRF遺伝子座にVenus（強化型黄色蛍光タンパク質）をノックインしたマウス（CRF-Venus）のPVHにおいてCRFニューロンとVenusニューロン分布は概ね一致していたが，二重免疫蛍光法を用いた詳細な検討を行った結果かなりの細胞において両者の発現に不一致が認められた．そこで，Venusノックインベクターに挿入されたネオマイシン耐性遺伝子（pgk-Neo）カセットのコンストラクトがCRF（および/またはVenus）発現に影響を及ぼしている可能性を疑った．このカセットを除去したマウス（CRF-VenusDeltaNeoマウス）を作成したところ，今度はCRFニューロンのほとんど全てでVenusの発現が観察された．したがって，CRF発現とVenus発現の不一致にはpgk-Neoが関与していたものと考えられる．
CRFニューロン蛍光標識マウスでPVHを含む急性スライスを作成し，Venus陽性ニューロンにガラス電極を当てwhole-cell clamp法により電位固定モードでVenusニューロンから電流信号を観察した．Venusニューロンからは興奮性後シナプス電流（EPSC）と抑制性後シナプス電流（IPSC）の両者が観察され，前者はGlu作動性，後者はGABA作動性入力であることが確かめられた．また，Venusニューロンで観察されたEPSC頻度が神経伝達物質ノルアドレナリンで有意に増加した．ノルアドレナリンはHPAを刺激することが知られるが， 本実験によりCRFニューロンへのGlu作動性入力を増強させることがそのメカニズムの一つであることが明らかにされた．しかしながらノルアドレナリンがどのニューロンに作用してVenusニューロンのEPSC頻度を増加させるかは未だ明らかでない．これについては現在検討中であるが，最近の検討でノルアドレナリンの作用はalpha-1アドレナリン作動性受容体によって媒介されることが明らかにされた．GABA作動性IPSCについても現在性格づけを行っているところである．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成26年度の研究において，Venus陽性ニューロンを用いてノルアドレナリンの作用メカニズムを検討することに成功した．ノルアドレナリンはグルタミン酸作動性EPSC頻度を増加させたが，振幅や減衰時間には影響をおよぼさず，presynapticの作用であることが示唆された．またaipha-1アドレナリン受容体拮抗薬プラゾシンによりノルアドレナリンの効果が阻害されたことから，aipha-1受容体によって媒介されることが明らかにされた．
26年度は,CRF-Venusノックインマウスゲノムからpgk-Neo配列を除去し新たなマウス（CRF-VenusDeltaNeoマウス）の作成に成功し，ほぼ全てのCRFニューロンを蛍光可視化することができるようになった．このマウスのVenus発現ニューロンの分布について詳細な組織学的性格づけを行ったのち，平成27年度中に国際誌に出版予定である．
このように，当初意図したよりも研究が進展している．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度は次の実験を行う予定である：
1. Ca2+イメージング：CRFニューロンにFura2添加後，灌流液中にノルアドレナリンを加え，細胞内Ca2+の変動を観察する．同時に（Venus陽性）CRFニューロンからwhole cell clampによりcurrent clamp modeで電位計測をおこない，Ca2+の変動が細胞発火と同期することを検証する．さらに，Aキナーゼ，CキナーゼやGタンパク阻害薬を用いてCa2+によって媒介される細胞内現象を解明する．
2. ノルアドレナリン作動性入力に加え，セロトニン（5-HT）作動性入力が（Venus陽性）CRFニューロンに及ぼす効果を検討する．また，5-HT受容体阻害薬や受容体選択的アゴニストを用いてどの受容体によって5-HTの作用が媒介されるかを明らかにする．
3. 得られた成果をAnnual Meeting of the Society for Neuroscience（2015年10月Chicagoにて開催）で報告する．
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| Causes of Carryover |
次年度使用額は，今年度の研究を効率的に推進したことにより発生した未使用額であり，平成27年度請求額とあわせ，平成27年度の研究遂行に使用する予定である．
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
ガラス電極購入費の一部に使用する．
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] Visualization of Corticotropin-Releasing Factor Neurons by Fluorescent Proteins in the Mouse Brain and Characterization of Labeled Neurons in the Paraventricular Nucleus of the Hypothalamus2014
Author(s)
Keiichi Itoi, Ashraf Hossain Talukder, Toshimitsu Fuse, Takuji Kaneko, Ryo Ozawa, Takayuki Sato, Takuma Sugaya, Katsuya Uchida, Maya Yamazaki, Manabu Abe, Rie Natsume, Kenji Sakimura
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Journal Title
Endocrinology
Volume: 155
Pages: 4054-4060
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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