エピジェネティクス解析を用いたヒスタミン産生調節因子の探索

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26461482
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 工藤 久智 東北大学, 東北メディカル・メガバンク機構, 助教 (80647678)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: ヒスタミン / ヒスチジン脱炭酸酵素

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、I型アレルギーや炎症反応を引き起こすヒスタミンを生体内で唯一合成可能な酵素・ヒスチジン脱炭酸酵素(HDC、L-histidine decarboxylase)遺伝子の転写活性機構について明らかにすることを目標としている。

研究代表者らのグループは、本研究開始時までにHdcプロモーター領域のメチル化や転写因子の結合能について研究し、遠位のエンハンサーと連携して働く基本的プロモーターの構造について明らかにした。
平成26年度からヒスタミン産生誘導実験と研究試料の調整としてマウスマスト細胞細胞株P815の脱メチル化による転写活性化実験を行った。P815細胞株は脱メチル化剤・5-アザシチジンを用いて処理すると脱メチル化が起こり、Hdc遺伝子の転写が活性化することが報告されており、同様の処理を行いクロマチン免疫沈降(ChIP)解析のための試料を調整した。この際に同時に調整した試料からcDNAを合成し、発現解析を行ったところHdc遺伝子の発現上昇が上記報告と同様に示された。同試料をもとにChIP解析を今後行う予定であるが、ChIＰ用の試料調整の条件検討、および、CTCFとH3K4me3の結合が予想されるHdcプロモーター領域についてChIP解析用のプライマーを設計した。設計した17箇所中15箇所については想定通りのPCR反応が確認された。
また、上記の解析を継続的に進めつつ、次世代シーケーンサーを用いたChIP-seq法を用いた解析法についても情報収集を行った。ChIP-seq法のシークエンス解析を所属施設内でで行うことを決定し、ChIP法との利点を比較しながら、研究方向および実験計画の修正を図っていく。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

ヒスタミン産生誘導実験と細胞試料の調整としてマウスマスト細胞細胞株P815の脱メチル化による転写活性実験を行った。P815細胞株を脱メチル化剤・5-アザシチジンを用いて処理するとプロモーター領域に脱メチル化が起こり、Hdc遺伝子の転写活性化が促進されることが報告されており(Suzuki-Ishizaki, Ohtsu, et.al., 2000)、同様の処理を行いクロマチン免疫沈降(ChIP)解析のための試料調整を行った。この際に同時に調整した試料からcDNAを合成し、発現解析を行ったところHdc遺伝子の発現上昇が上記報告と同様に示された。同試料をもとにChIP解析を今後行う予定であるが、ChIＰ用の試料調整の条件検討、および、CTCFとH3K4me3の結合が予想されるHdcプロモーター領域についてChIP解析用のプライマーを設計した。設計した17箇所中15箇所については想定通りのPCR反応が確認された。こちらの解析を継続的に進めるとともに同様に調整した試料で解析が可能なChIP-seq法について情報収集を行い、同組織内に設置されている次世代シーケンサーの使用について相談中である。

Strategy for Future Research Activity

計画していた腹腔マクロファージへの大腸菌感染実験と骨髄由来培養マスト細胞を用いたアレルギー反応実験を行い、さらに解析を進行させる。昨年度までに実施したマウスマスト細胞細胞株P815の5-アザシチジン処理実験と合わせてChIP解析によるHdc転写活性領域の検討を行うことによりアレルギー反応や感染炎症時に特異的なHdc転写制御領域を明らかにする。さらに得られる知見をもとにBACトランスジェニックレポーターマウスを作成し、大腸菌感染によるヒスタミン産生の誘導実験を行い、生体内のGFP強度を観察・測定し、野生型のBACを導入したマウスとの結果と比較検討を行う。
また、ChIP-seq法についてはChIP法との利点を比較しながら、研究方向を適宜修正しながらHdc遺伝子の転写活性化領域の決定方法について検討を行い、得られる実験結果を元に論文の執筆を行う。

Causes of Carryover

平成28年度までにマウスマスト細胞株P815の脱メチル化による転写活性化実験を行い、解析を進める予定であった。実験条件や新規解析技術ChIP-seq法について検討を行った結果、次年度使用額が生じた。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度使用額の研究費については、定量PCR用のプライマーおよび試薬キット類の購入、抗体類やChIP実験のための試薬消耗品類の購入、その他細胞生物学的、分子生物学的研究に必要な試薬・キット類、細胞および細菌培養培地類、プラスチック・ガラス器具類、一般試薬類、消耗品類の購入に当てる予定である。また、50万円を超える設備、備品類の購入の予定はない。

Research Products

• [Presentation] Reliability of ID Management in a Japanese Population-Based Biobank (2016)
  • Author(s): Hisaaki Kudo, Ichiko Nishijima, Takahiro Terakawa, Takahiro Nobukuni, Noriko Ishida, Riu Yamashita, Yumi Yamaguchi-Kabata, Kaname Kojima, Sakae Saito, Soichi Ogishima, Fumiki Katsuoka, Masao Nagasaki, Jun Yasuda, Mamoru Satoh, Naoko Minegishi, Makoto Sasaki, Masayuki Yamamoto
  • Organizer: Europe Biobank Week 2016
  • Place of Presentation: オーストリア、ウィーン
  • Year and Date: 2016-09-13 – 2016-09-16
  • Int'l Joint Research