2016 Fiscal Year Research-status Report

RNAiを用いた緑膿菌バイオフィルム感染症に対する新しい治療戦略

Research Project

Project/Area Number	26461511
Research Institution	Oita University
Principal Investigator	平松和史大分大学, 医学部, 准教授 (80301381)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	門田淳一大分大学, 医学部, 教授 (50233838)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2018-03-31
Keywords	緑膿菌 / siRNA / バイオフィルム / グリコカリックス / アルギン酸
Outline of Annual Research Achievements	平成26年度、27年度に引き続き、緑膿菌バイオフィルム形成において重要なグリコカリックスやアルギン酸産生に対するRNA干渉によるin vitroでの抑制効果について検討を行った。平成26年度、27年度に設計あるいは作成したグリコカリックス関連遺伝子PelAおよびPslAに対する各種siRNAにコレステロール修飾を行った。こうしたコレステロール修飾siRNAは緑膿菌に高効率に取り込まれていることは昨年度までの本研究において確認している。本年度もグリコカリックス産生に対するコレステロール修飾siRNAの効果をシリコン片に付着させた緑膿菌に作用させ、シリコン片上のグリコカリックス量をクリスタルバイオレット法で定量した。コントロール群と比べ、コレステロール修飾siRNA作用群でもグリコカリックス産生の抑制効果を認めなかった。コレステロール修飾以外の修飾法としてグルコースやメチオニンによるsiRNAの修飾法があるが、PelAおよびPslAに対するsiRNAをグルコースあるいはメチオニンで修飾した。いずれの方法でも蛍光色素を付着したグルコースあるいはメチオニン修飾siRNAでは非修飾siRNA群に比べ、菌体内に多く取り込まれていることが共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いた検討で明らかとなった。現在このようなコレステロール修飾以外の修飾siRNAを用いたグリコカリックス産生抑制効果についてクリスタルバイオレット法を用いて検討を行っている。またこれまで用いてきた以外のsiRNA配列候補を設計し、作成については外部業者に依頼を予定している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 4: Progress in research has been delayed. Reason 緑膿菌ムコイド株に対するAlgUに対するsiRNAを用いた検討を今年度は予定していたが、グリコカリックスの産生抑制効果を認めなかったため、アルギン酸産生の抑制効果の検討については実施できていない。またマウス腹腔内バイオフィルム感染モデルにおけるグリコカリックスやアルギン酸産生に対するsiRNAの効果の検討を行う予定であった。しかしながら、in vitroでの効果の評価が十分に行えていないため、in vivoでの検討も実施できていない。こうしたことから、遅れていると評価した。
Strategy for Future Research Activity	平成29年度もin vitroにおけるPelA、PslA、AlgUのsiRNAの効果について検討を行う。PelA、PslAに対するsiRNA配列を多種類作成し、グリコカリックス産生の抑制効果を得られる配列を探索する。in vitroでのグリコカリックス産生抑制効果を示すsiRNAを見い出すことができれば、マウス感染モデルにおけるsiRNAの効果について検討を進めていくこととしている。
Causes of Carryover	コレステロール修飾siRNAによるグリコカリックス産生抑制効果について検討を行ったが、その効果を認めるsiRNAを検出することができていない。そのためにin vivoにおけるマウス腹腔内バイオフィルム感染モデルを用いたsiRNAの効果の検討を行うことができなかった。この理由からマウスの購入やin vivoでの検討に使用予定であった試薬などの消耗品の購入を行わなかったため、次年度使用額が生じた。さらにグルコースやメチオニン、グルコース修飾のsiRNAは平成27年度に購入していたため、平成28年度は前年度までに購入した消耗品を用い検討を行った。平成28年度に使用を予定していた経費を使わず、次年度使用額が生じた。
Expenditure Plan for Carryover Budget	現在検討しているコレステロール修飾siRNAに加えて、グルコースやメチオニン修飾のいろいろな配列のsiRNAを外部業者に委託し作成、購入を行う予定である。in vitroでグリコカリックス産生抑制効果を得られたsiRNAを用いて、in vivoでの実験を行う予定としている。in vivoで用いるマウスや試薬、消耗品の購入を行う予定である。