New therapeutic strategy to biofilm formed infection caused by Pseudomonas aeruginosa

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26461511
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 平松 和史 大分大学, 医学部, 教授 (80301381)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 門田 淳一 大分大学, 医学部, 教授 (50233838)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 緑膿菌 / siRNA / バイオフィルム / グリコカリックス / アルギン酸

Outline of Annual Research Achievements

平成28年度に引き続き緑膿菌バイオフィルム形成に重要な役割を果たしているグリコカリックス産生に対するRNA干渉によるin vitroでの抑制効果について検討した。前年度までに作成したグリコカリックス関連遺伝子であるPelAあるいはPslAに対するsiRNAでは十分な効果が認められなかったことから、新たなPslAに対するsiRNAを設計した。設計したsiRNAの合成を外部業者に委託し、作成を行った。作成したsiRNAを緑膿菌内への取り込み効率を上げるためにコレステロールで修飾した。これらの新しい修飾siRNAを蛍光色素で付加し、共焦点レーザー蛍光顕微鏡による菌体内への取り込みの状況を確認した。これまでに検討した他のsiRNAと同様に、コレステロールで修飾したsiRNAは、修飾していないsiRNAと比較し、効率よく緑膿菌の菌体内に取り込まれていた。また前年度までに合成したsiRNAの菌への取り込みをより高効率とするためにコレステロール以外の修飾物質としてグルコースやメチオニンで修飾を行った。グルコースあるいはメチオニン修飾siRNAも蛍光付加を行い、共焦点レーザー蛍光顕微鏡で菌への取り込みを観察したところ、コレステロール修飾siRNAと同等に取り込まれていた。これらのコレステロール、グルコースあるいはメチオニンで修飾したsiRNAを用いて、シリコン片に付着させた緑膿菌に作用させ、培養後のシリコン片上のグリコカリックス量をクリスタルバイオレット法で定量した。新たに作成したsiRNAにおいても、コントロール群に比べ、有意なグリコカリックス産生の抑制効果は認めなかった。