2016 Fiscal Year Annual Research Report
Modification of radio-sensitivity of cancer by miRNA delivery taking advantage of the exosome.
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26461882
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
小川 良平 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 准教授 (60334736)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鍵谷 豪 北里大学, 医療衛生学部, 准教授 (30524243)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | エクソソーム / miRNA / shRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
HEK293細胞への中性スフィンゴミエリナーゼ2遺伝子とTSAP6遺伝子の過剰発現によって、エクソソーム（Ex）の分泌の上昇が認められたが、両者とも２倍には達さない程度であった。また、両者を同時に過剰発現する細胞を構築したところ、相加的な分泌量の向上が認められた。
クローニングしたhnRNPA2B1遺伝子を安定的に導入した細胞を構築し、リアルタイムPCRで過剰発現を確認したが、配列分析の結果、変異の導入が確認され、タンパク発現については検出できなかった。そこで、hnRNPA2B1遺伝子のmRNAを元にcDNAを８クロン独立にクローニングしてそれぞれ塩基配列を確認してみたところ、すべてに変異が導入されていた。自力でのクローニングを諦め、外注して塩基配列をもとに化学合成による構築おこなった。しかしながら、発現ベクターへのサブクローニングがうまくいかず現在も検討中である。したがって、hnRNPA2B1が認識する配列を導入したルシフェラーゼの発現を抑制するshRNAのExへの封入やその遺伝子導入効率などの検討については未達となっている。
UHRF1に対するshRNAについては、ヒト胎児腎臓由来のHEK293細胞に導入し、放射線感受性について調べた。5 Gy照射後のコロニー形成で観察したところ、HEK293が形成するコロニーが明確ではなく、データが安定しなかったが、コロニー数としては70%程度まで減少することを確認した。
３年目で完全に終了することができなかったが、検討はかなり進んでいると考える。ただ、もっとも重要なステップの一つであるhnRNPA2B1遺伝子によるshRNAのEx中への封入についての検討が未達で、その周辺の検討ができなかったのが残念である。全体を通して60-70%程度の完成度であった。今後も検討を進めていき、最終的な結論を情報発信したい。
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