次世代シーケンサーを用いた大腸癌末梢血の抗EGFR抗体非侵襲的感受性診断の検討

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462013
• Research Institution: Sapporo Medical University
• Principal Investigator: 竹政 伊知朗 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50379252)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水島 恒和 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座教授 (00527707) ; 山本 浩文 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (30322184) ; 佐藤 太郎 大阪大学, 医学系研究科, 寄附講座教授 (40368303) ; 畑 泰司 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (70644912)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 大腸がん / 非侵襲性KRAS変異検査 / 次世代シーケンサー / 感受性性診断

Outline of Annual Research Achievements

進行大腸癌に対する抗EGFR療法のbenefitは野生型KRASの患者に限られているため、生検サンプルなどあらかじめ癌組織の遺伝子検査を行い、適用のある患者を選別する必要がある。KRAS変異は抗EGFR治療中にも獲得されることが認識され、獲得耐性の重要なメカニズムの一つとして提唱されるようになった。血液中から低頻度の変異クローンを検出できれば、原発巣が野生型の患者が治療経過中変異を来した場合、無益な治療の継続を回避することが可能となり、診断精度の改善および費用対効果の改善につながることが期待される。本研究では、従来の検査の感度を向上させることで血液検体を用いた非侵襲性KRAS変異検査を確立し、病勢モニタリングや耐性変異を標的とする新しい分子標的薬の適用決定など新しい用途の研究開発を行うことを目的としており、昨年同様に札幌医科大学および大阪大学と基幹関連施設での高度進行大腸癌の標本を集積・保管するシステムを構築した。
次世代シーケンサーを用いた血漿中大腸癌由来変異DNA検出法を確立するため、実験系のバックグラウンドノイズを測定し、コマーシャルのゲノムDNAサンプルを用いた解析により条件設定を完了した。また、実際の臨床サンプル（原発巣、生検サンプル、血液）を対象としてKRAS変異の相同性について検証した。サンプルから、組織、術前血漿でのmutationの割合が高く、術後の血漿においては、mutationが少なくなっていることが確認された。これらの結果は、薬剤感受性、病態などを予測するのに重要な情報を与えると考えられる。
以上のように、血液中のcfDNA（セルフリーDNA）の解析により、大腸癌組織の変異を検出できる可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでに札幌医科大学、大阪大学およびその基幹関連施設からなる臨床試験推進組織である大腸疾患分科会をベースに、対象となる高度進行大腸癌症例の標本（原発巣、生検サンプル、全血）臨床病理所見データの回収・保管システムを引き続き構築した。
生検サンプルではKRAS変異と血液サンプルでのKRAS変異の相同性についてさらに症例数を増やして、生検と血液サンプル中とのKRAS変異結果の検証を続け、薬剤応答との比較により、その感度と特異度を調べている。
組織サンプルも合わせて解析し、heterogeneityの検討と、その後の血漿サンプルのタイムコースを取得し、耐性変異の検出を目指すため、遠隔転移を有し、薬剤投与によって腫瘍は縮小したケース、一旦腫瘍縮小効果が得られたもののfailureして、腫瘍増大に転じたケースのサンプルを継続して収集している。また前回、ctDNAの収量が良くなかったサンプルについては、組織からのDNAを活用して、KRASとCancer Panel（他の遺伝子）で変異を調べるとともに、血漿サンプルについてPCRで増幅が可能であるかどうかを検討している。札幌医科大学へ異動後も、引き続きDNAチップ研究所と共同研究契約をし、札幌医科大学にてサンプルを収集し、解析を行っているが当初の予定より解析に時間がかかっている。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度に引き続き、生検サンプルではKRAS変異と血液サンプルでのKRAS変異の相同性について、さらなるサンプルを解析しその感度と特異度を明らかにする。
50症例以上のサンプルについて、前向き試験を行う。
これまでの後向きサンプルの結果と同じ感度、特異度が再現しない可能性がある。
その場合、スレッシュフォールドの見直し、臨床情報による層別解析をおこない、感度、特異度を高める検討を行う。KRAS野生型患者を対象に、抗EGFR抗体導入前後、増悪後の各ポイントで血液を測定し、化学療法中の簡便なKRAS測定による極めの細かい個別化化学療法の実践の可能性を検討する。

Causes of Carryover

対象となるサンプルについて、血液中と生検でのKRAS変異結果と合致した結果が得られるかどうか検討する感度のスレッシュフォールドを決定するために薬剤応答など他の臨床情報との関連解析を行なうため

Expenditure Plan for Carryover Budget

サンプルの関連解析を行うために必要な物品を購入予定であり、国内共同研究者との打ち合わせなどの旅費に使用予定である。