2014 Fiscal Year Research-status Report
ヒト腸管粘膜固有層におけるCD11ｃ陽性抗原提示細胞の系統的機能的解析
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26462014
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
西村 潤一 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (20379209)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
香山 尚子 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40548814)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | ヒト腸管粘膜固有層 / 樹状細胞 / CD11c / 炎症性腸疾患 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸癌症例非癌部を採取し、20mMEDTAによる上皮細胞除去後、筋層を剥離し、さらに酵素処理の後、粘膜固有層内の単核球を分離しFACSにより細分化した。Lin（CD3,CD19,CD20,CD56）陰性HLADR陽性細胞をCD14とCD11cで展開するとCD14-CD11c+、CD14+CD11c+、CD14-CD11c-の分画が得られた。CD14+CD11c+の分画はさらにCD163によりCD163highとCD163lowに細分化された。CD14-CD11c+細胞はMay-Giemsa染色によりN/C比がリンパ球より小さく大きさがリンパ球と同等かより大きい細胞であることが確認できた。Populationは検体により個人差を認めるが、Lin-HLADR+細胞のうち約30%を占めていた。採取したCD11cの表面マーカーを調べたところ、CD86陽性、CD80陰性、CD83陽性、CD64陰性、CD11b陽性、CD141陽性、CD172a陽性、CD1c陽性であり、樹状細胞で陽性となるマーカーが多く樹状細胞様の性質を持っていることが推察された。さらにCD103によってCD103陰性の部分とCD103陽性の部分の2つに細分化されることが分かった。Lin-HLADR+細胞集団からFACSにより細分化されるCD14+CD11c+CD163highとCD14+CD11c+CD163low、CD14-CD11c+、CD14-CD11c+に対しマイクロアレイ解析を行ったところ、CD14-CD11c+は他の細胞集団に比しCD103、TLR3、IRF4が高発現であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ヒト正常腸管は大腸癌患者の手術症例で得られた標本の腫瘍以外の部分を採取することによって入手しているが、術式により得られる腸管の部位、大きさが異なり、この点が実験施行及び実験結果に大きく影響している。すなわち、十分な腸管の大きさがなければ腸管粘膜固有層の単核球を必要量得られず、FACSによるsortingが不可能なことがある。また、十分な大きさの腸管であっても術前の栄養状態や炎症所見、さらには年齢などによる個体差により、同じプロトコールを用いても得られる腸管粘膜固有層の単核球の数が一定でなく、十分量の細胞が採取できないことがある。細胞数が少なければsorting後の実験に支障をきたし十分な解析が行えない。特にマイクロアレイ解析を行う際には十分量のmRNAが収量できず、またmRNAを抽出してもqualityが低くマイクロアレイ解析に耐えられず当初の予定であった10例では不足し、20例を要した。CD14+CD11c-の細胞集団がCD103で2つの細胞集団に細分化されるため、今後はCD103で細分化して解析を行う予定であるが、個人差が大きく結腸の部位による違いも考慮する必要があると感じている。当初10例の解析で十分と考えているが、腸管の各部位を5例ずつ解析するとしても少なくとも30例近くの検体が必要である。以上より個人差による違い、検体採取の機会が限られていることが最も実験の進捗に影響を与えていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
CD14-CD11c+細胞集団がCD103で2つのpopulationに細分化されるという結果を踏まえて、CD14-CD11c+CD103+細胞とCD14-CD11c+CD103-細胞の解析を進める。すなわち、これらの細胞集団をFACSにより表面マーカー発現を解析する。また、これらの細胞をsortingし、mRNAを抽出してcDNAライブラリを作成する。qRT-PCRによりこれらの細胞のサイトカイン及びTLRなどのmRNA発現を解析する。また、sortingした細胞をTLR刺激下で培養することでサイトカイン産生をELISAで解析する。
ヒト血液からMACSにより採取したNaïve T cellとともにCD14-CD11c+CD103+細胞、CD14-CD11c+CD103-細胞をそれぞれ培養し、培養後のT細胞の細胞内のTh17とIFNγを染色し、FACSによりこれら細胞のT細胞の分化誘導能を解析する。また、培養液中のサイトカインをELISAを用いて解析する。培養後のT細胞を採取し、cDNAライブラリを作製し、サイトカイン発現を解析する。
IBD患者の腸管切除症例の検体を用いてCD14-CD11c+CD103+細胞とCD14-CD11c+CD103-細胞の解析を行う。すなわち、CD14-CD11c+CD103+細胞とCD14-CD11c+CD103-細胞をsortingし、cDNAライブラリを作製し、qRT-PCRよりサイトカインやTLRの発現を解析する。また、soritngした細胞をTLR刺激下で培養することでサイトカイン産生をELISAで解析する。さらにヒト血液からMACSにより採取したNaïve T cellとともにCD14-CD11c+CD103+細胞、CD14-CD11c+CD103-細胞をそれぞれ培養し、T細胞の分化誘導能を解析する。また、培養液中のサイトカインをELISAを用いて解析する。培養後のT細胞を採取し、cDNAライブラリを作製し、サイトカイン発現を解析する。
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| Causes of Carryover |
CD14-CD11c+細胞集団がCD103で2つのpopulationに細分化されるという結果を出すのに必要となった物品、施設の料金などを払い終えたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
CD14-CD11c+CD103+細胞とCD14-CD11c+CD103-細胞の解析を行い、培養後のT細胞を採取し、cDNAライブラリを作製し、サイトカイン発現を解析するために必要な物品を購入するため。
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