2014 Fiscal Year Research-status Report
膵癌幹細胞におけるCD133依存性シグナルの解明とシグナル反応性miRNAの解析
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26462069
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
松原 修一郎 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 准教授 (60199841)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高尾 尊身 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 特任教授 (80171411)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 癌幹細胞 / シグナル伝達 / 膵臓癌 / CD133 / miRNA / Hedgehog / mTOR / Slug |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の目的は、膵癌幹細胞におけるCD133依存性シグナルを明らかにすることである。細胞表面タンパクCD133は多くの癌で癌幹細胞マーカーであることが報告されている。我々は膵癌培養細胞において、CD133の発現が、造腫瘍性、薬剤耐性、遊走能および浸潤能などの癌幹細胞様形質と相関していることを明らかにしている(Hayashi他 2012、Ding他 2012)。本研究では我々の樹立したCD133高発現細胞およびノックダウン細胞を用いてCD133依存性シグナルが癌幹細胞様形質とどのようにかかわっているかを明らかにする。膵癌は現在もきわめて予後不良の癌(5年生存率10%以下)であり、早期診断法ならびに新たな治療法の開発が急務である。膵癌細胞の幹細胞性維持に働くメカにズムを明らかにし、これを標的とした治療法を開発することで、根治につながることが期待できる。
実施計画としては、大きく分けて２つあり、(1) CD133の下流に存在するシグナル分子について、タンパク質のリン酸化、切断、局在性の変化、あるいは転写制御などを介したシグナル伝達について検討する。(2) CD133の発現とmiRNAの発現パターンとの関連を明らかにし、miRNAを介したCD133の細胞機能制御について検討する。
H26年度は、(i)タンパクを介したシグナルについては、CD133依存性シグナルの仲介因子候補Slugと膵癌幹細胞様性質との関連を調べ(Tsukasa他 投稿中)、また、膵癌幹細胞様性質維持におけるHedgehogおよびmTORシグナルの重要性について明らかにした(Miyazaki他 投稿中)。次に、(ii) miRNAとの関連については、CD133の発現とmiR30ファミリーの発現レベルとの相関を示し、さらに、機能的な関連性を調べる目的でmiR30a、bおよびc1の強制発現細胞を樹立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、現在その機能が明らかにされていない幹細胞マーカーCD133(5回膜貫通型膜タンパク)について、この分子の機能、すなわちこの分子に依存した細胞内シグナルの実体を解明し、さらには、そのシグナルと膵癌幹細胞の幹細胞様性質との関連を明らかにすることである。この目的に対して、(1)CD133およびその下流に存在するシグナル分子について、タンパク質のリン酸化、切断、局在性の変化あるいは転写制御などを介したシグナル伝達についての検討、および(2)miRNAを介した細胞機能の制御についての検討を申請書に記載した。
H26年度は、(2)についてmiRNAのmiRNA30ファミリーがCD133の作用を仲介してしいる可能性を示唆する結果が得られた。CD133高発現膵癌細胞とCD133ノックダウン細胞の比較から、マイクロアレイおよびRT-PCR解析によって、CD133発現に依存してmiR30ファミリーのmiRNA、miR30a、miR30b、miR30c、miR30eの発現量が増加していることが明らかになった。一方、これらのmiRNAの発現上昇の効果を調べるため、遺伝子導入によってmiR30a、miR30b、miR30c1の強制発現細胞を樹立したところ、遊走能ならびに浸潤能が増加する傾向がみられた。この結果はCD133発現量増加による変化と対応している。さらに、(1)において、CD133ノックダウン細胞で大きく発現の低下する転写因子Slugについて、shRNAの導入によるノックダウン細胞を用いて解析を行った結果、CD133ノックダウン細胞と同様に抗癌剤にする耐性が低下する結果が得られている。また、癌幹細胞性の維持に働くシグナル経路としてHedgehogおよびKRAS-PI3K-mTOR経路について解析し、両者の関係について再検討することが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
H26年度までの研究の結果、膵癌幹細胞のモデルCapan-1M9細胞では、CD133発現の有無によって、膵癌幹細胞様の性質あるいはEMT(上皮間葉転換)関連の性質が変化し、この間葉的形質の増強には転写因子SlugならびにmiRNA miR30ファミリーが関与していることが示唆された。また、膵癌幹細胞様の性質の維持に重要であると考えられる2つのシグナル経路、KRAS-PI3K-mTOR経路とHedgehog経路の作用について検討をおこなったが、近年注目されているS6キナーゼ(mTORキナーゼのリン酸化基質)を介したクロストークのみでは、上記の細胞に対するこれらシグナル経路阻害剤の作用を説明することができず、異なったメカニズムで癌幹細胞様形質に寄与しているものと判断された。以上の結果、膵癌幹細胞におけるCD133依存性のシグナルの機能について、大きな枠組みはある程度見えてきたように思われる。今後は、これをもとにして上記の内容についてさらに詳細な検討を続けるとともに、(1)miRNA miR30ファミリーについては、CD133mRNA上にmiR30の標的配列のあることがデータベースの検索よりわかっており、したがって、miR30によるCD133タンパクレベル制御の可能性があるので、これについて検討し、CD133によるmiR30ファミリー発現制御への一方向の作用なのか、あるいはループをつくっているのかを明らかにする。また、(2) CD133による間葉系誘導転写因子Slugの発現制御メカニズムを明らかにするために、CD133近傍の生化学的解析をおこなう。Wei他(2013)によれば、グリオブラストーマではPI3Kの調節サブユニットp85がCD133に直接結合し、PI3K-mTOR経路を活性化するという機構が存在するとされており、同様のことが膵癌細胞でも起こっているか否かを検討する。
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Research Products
(3 results)
