2016 Fiscal Year Research-status Report
膵癌幹細胞におけるCD133依存性シグナルの解明とシグナル反応性miRNAの解析
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26462069
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
松原 修一郎 鹿児島大学, 医用ミニブタ・先端医療開発研究センター, 准教授 (60199841)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高尾 尊身 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (80171411)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 癌幹細胞 / 膵臓癌 / CD133 / マイクロRNA / Slug / HIF-1 / EMT / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
「研究の目的」本研究課題の目的は、膵癌幹細胞におけるCD133依存性シグナルを明らかにすることである。細胞表面タンパクCD133は多くの癌で癌幹細胞マーカーであることが報告されている。我々は膵癌培養細胞において、CD133の発現が、造腫瘍性、薬剤耐性、遊走能および浸潤能などの癌幹細胞様形質と相関していることを明らかにしている(Hayashi他 2012、Ding他 2012)。本研究では我々の樹立したCD133高発現細胞およびノックダウン細胞を用いてCD133依存性シグナルが癌幹細胞様形質とどのようにかかわっているかを明らかにする。
膵癌は現在もきわめて予後不良の癌(5年生存率10%以下)であり、早期診断法ならびに新たな治療法の開発が急務である。膵癌細胞の幹細胞性維持に働くメカにズムを明らかにすることによって、これを標的とした治療法を開発し、根治に導くことが期待できる。
「研究実施計画」実施計画としては、大きく分けて２つあり、(1) CD133の下流に存在するシグナル分子について、タンパク質の発現量、リン酸化、切断、局在性の変化、あるいは転写制御などを介したシグナル伝達について検討する。(2) CD133の発現とmiRNAの発現パターンとの関連を明らかにし、miRNAを介したCD133の細胞機能の制御について検討する。
「H28年度に実施した内容」H28年度は、(1)タンパクを介したシグナルについて、より生体内にちかい低酸素条件で検討し、鍵レギュレーターHIF-1alphaの発現がCD133によって制御されることを明らかにした。また、(2) miRNAについては、miR30aの強制発現によって、mRNAレベルが変化する遺伝子の検索を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的は、幹細胞マーカーCD133(5回膜貫通型膜タンパク)について、この分子の機能、すなわちこの分子に依存した細胞内シグナルの実体を解明し、さらには、幹細胞様性質との関連を明らかにすることである。
H28年度は、新たに低酸素状態でのCD133の作用を検討し、細胞の低酸素反応における鍵レギュレーターHIF-1alphaのタンパク量がCD133の発現によって増加することを明らかにした。この結果、EMT(上皮間葉転換)誘導因子Slugの発現(mRNAレベル)が上昇するとともに、細胞の運動能が増加し、間葉系マーカー(N-カドヘリン)の発現上昇が認められた。低酸素状態では、CD133の発現に依存してHIF-1alphamRNA量が増加しており、いっぽうでHIF-1alphaタンパクの分解が抑制される結果、タンパク量の差となって表れるものと判断された。
また、H27年度までの研究でCD133の下流ではたらいていることが示されたmiR-30ファミリーのmiR-30aについて、これを強制発現させた細胞と親株(コントロール)をmRNAのマイクロアレイ解析で比較し、miR-30aによって発現の変化する遺伝子の検索をおこなった。得られた結果について、miR-30a標的配列の存在や細胞の運動能との関連からさらに解析をおこなったが、ターゲット遺伝子の有力な候補は得られなかった。
以上、26年度から28年度の研究をとおして、幹細胞マーカーCD133陽性膵癌細胞では、転写因子SlugならびにmiRNA のmiR30ファミリーが関与したシグナルによってEMT(上皮間葉転換)様の変化が起こり、低酸素下ではHIF-1alphaの発現上昇によりこのシグナルが強化されることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
H28年度までの研究の結果、(我々が樹立した)膵癌幹細胞のモデルCapan-1M9細胞では、幹細胞マーカーCD133発現の有無によってEMT(上皮間葉転換)関連の性質が変化し、間葉的形質の増強には転写因子Slug、miRNA miR30ファミリー、さらに低酸素下ではこれらに加えてHIF-1alphaが関与していることが示された。また、膵癌幹細胞様性質の維持にKRAS-PI3K-AKT-mTOR経路とHedgehog経路の2つのシグナル経路が重要であることを明らかにしてきた。活性化KRASは、Hedgehog経路も活性化することが膵癌細胞において報告されており(Ji, Z. et al. 2007)、RAF-MEK-MAPK経路の関与が言われている。Capan-1M9細胞においては、MEK阻害剤U0126がCD133およびSlugの発現を低下させる一方で、免疫沈降実験においてCD133とERK (MAPK)が共沈することを我々は見ている。さらに、この細胞ではEGFシグナルに依存した間葉系マーカー(N-カドヘリン)誘導の際に、CD133のノックダウンがこの発現誘導を低下させることが示唆されている。膵癌においては、KRASが癌化のキー遺伝子であり、その下流のPI3K-Akt-mTOR経路あるいはRAF-MEK-MAPKからHedgehog経路へのシグナルとCD133の関係が重要であると判断され、この点を明らかにすることが今後の課題である。このため、i) EGF刺激後のCD133(細胞内ドメイン)のリン酸化に状態の変化に焦点をおいた解析を進める、とともにii) PI3K-AKTのシグナルがmTOR複合体1および2を介して膵癌幹細胞様性質の維持にどのような作用をもつかを明らかにしていく。また、iii) これらとmiR30の関連について検討する。
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| Causes of Carryover |
H28年初めに投稿した論文について編集部とのやり取りが通常予測されるよりも長い期間を要し、また、多くの追加実験を要求されたため、これを行うため時間を要した。この論文はH28年度中に受理されたが、上記のため次に投稿を予定していた論文の作成が遅れ、H28年度中に終了しなかった。現在その後の研究の進展を含めて論文の作成を急ぎ、また、学会での発表をするため準備しているところである。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
論文投稿のための英文校閲料、投稿料および追加実験のための消耗品費として使用するとともに、学会発表のための旅費とする。
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Research Products
(3 results)
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[Presentation] Hedgehog/GLI and mTOR signals in pancreatic cancer stem cells2016
Author(s)
Matsubara, S., Miyazaki, Y., Tsukasa, K., Obara, T., Matsuyama, T., Takao, S.
Organizer
第75回日本癌学会学術総会
Place of Presentation
パシフィコ横浜 (神奈川県横浜市)
Year and Date
2016-10-06
