2014 Fiscal Year Research-status Report
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26462070
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
遠藤 格 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (60211091)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
廣島 幸彦 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 客員研究員 (60718021)
森 隆太郎 横浜市立大学, 医学部, 助教 (90596412)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 膵癌 / マウスモデル / 膵炎 / Kras / CRMP4 / リン酸化 / CDK5 / GSK3β |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【CRMP4の高発現、低発現の膵癌細胞株を用いたCRMP4リン酸化の意義の検証】
CRMP4-EGFPをCRMP4低発現株であるPanc1に導入し、安定発現株(Panc1-CRMP4-EGFP)を樹立し、浸潤能、転移能を比較検討する。申請者らは既にCRMP4の安定発現株の樹立に成功し、CRMP4の安定発現株で有意にFilopodia（糸状仮足；細胞の浸潤に不可欠）の形成を認めた。次にこのPanc1-CRMP4-EGFPにCRMP4のリン酸化酵素阻害薬であるCDK5阻害薬とGSK3β阻害薬を投与し、Filopodia形成の変化を観察した。その結果、CDK5阻害薬の添加ではFilopodia形成に変化を認めなかったが、GSK3β阻害薬を添加すると有意にPanc1-CRMP4-EGFPのFilopodia形成が減少した（未発表データ）。以上から、膵癌においてCRMP4がGSK3βによりリン酸化され、浸潤（Filopodia）能を促進している事が示唆された。
【CRMP4ノックアウトマウスを用いた膵癌自然発癌モデルの作成】
KrasG12Dマウスを入手し、CRMP4ノックアウトマウスとの交配、飼育を行っており、今年度中にCRMP4ノックアウト膵癌マウスを作製できる見込みである。また、慢性膵炎は膵癌発症のリスクが13倍以上になることが報告されており、膵癌発癌の強いリスク因子と考えられ、我々はマウスの急性膵炎モデル、慢性膵炎モデルにおいて主に間質に浸潤したT細胞と一部腺房細胞の細胞質にCRMP4が発現しており、かつリン酸化されていることを解明した（Plos One投稿中）。T細胞にCRMP4が発現していることからCRMP4は免疫系にも関わっていることが示唆され、膵癌浸潤能のみならず別の側面で膵癌進展に関与していると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通り、CRMP4の安定発現株の樹立し、CRMP4の安定発現株で有意にFilopodia（糸状仮足；細胞の浸潤に不可欠）の形成を認めた。さらに、Panc1-CRMP4-EGFPにCRMP4のリン酸化酵素阻害薬であるCDK5阻害薬とGSK3β阻害薬を投与し、Filopodia形成の変化を観察した。その結果、CDK5阻害薬の添加ではFilopodia形成に変化を認めなかったが、GSK3β阻害薬を添加すると有意にPanc1-CRMP4-EGFPのFilopodia形成が減少した（未発表データ）。以上から、膵癌においてCRMP4がGSK3βによりリン酸化され、浸潤（Filopodia）能を促進している事が示唆された。
また、【CRMP4ノックアウトマウスを用いた膵癌自然発癌モデルの作成】においては、申請者らはすでにKrasG12Dマウスを入手し、CRMP4ノックアウトマウスとの交配、飼育を行っており、今年度中にCRMP4ノックアウト膵癌マウスを作製できる見込みである。さらにこの発癌モデルを作成する過程で、マウスの急性膵炎モデル、慢性膵炎モデルにおいて主に間質に浸潤したT細胞と一部腺房細胞の細胞質にCRMP4が発現しており、かつリン酸化されていることを解明した（Plos One投稿中）。T細胞にCRMP4が発現していることからCRMP4は免疫系にも関わっていることが示唆され、膵癌浸潤能のみならず別の側面で膵癌進展に関与していると考えられた。以上のことから、概ね順調に研究は進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
【CRMP4の高発現、低発現の膵癌細胞株を用いたCRMP4リン酸化の意義の検証】
前述したように、申請者らはPanc1-CRMP4-EGFPにCRMP4のリン酸化酵素阻害薬であるCDK5阻害薬とGSK3β阻害薬を投与し、Filopodia形成の変化を観察し、CDK5阻害薬の添加ではFilopodia形成に変化を認めなかったが、GSK3β阻害薬を添加すると有意にPanc1-CRMP4-EGFPのFilopodia形成が減少することを発見した。今後は、in vitro（invasion assay）, ex vivo（3D神経浸潤モデル）, in vivo（同所移植モデル）でのGSK3β阻害薬を含む各種リン酸化酵素阻害薬の効果を浸潤能、転移能において評価する。
【CRMP4ノックアウトマウスを用いた膵癌自然発癌モデル実験系】
KrasG12Dマウスを入手し、CRMP4ノックアウトマウスとの交配、飼育を行っており今年度中にCRMP4ノックアウト膵癌マウスを作製できる見込みであるので、今後は通常膵癌マウスと生存期間、腫瘍径、遠隔転移、神経浸潤を比較検討しCRMP4の膵癌進展における役割を詳細に解析する。また、各種臓器を摘出しCDK5、Sema3A、GSK3βなどの他の蛋白との関連性を免疫染色、Western Blotting、RT-PCRにより解明して行く。また、上記細胞実験で効果の認められた阻害薬を両モデルマウスに投与し、その膵癌進展における効果を検証する。
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| Causes of Carryover |
CRMP4ノックアウトマウスを用いた膵癌自然発癌モデルの作成する過程で、マウスの急性膵炎モデル、慢性膵炎モデルにおいて主に間質に浸潤したT細胞と一部腺房細胞の細胞質にCRMP4が発現しており、かつリン酸化されていることを発見し、この機序の解明に時間を費やしたため、予定していたin vitro（invasion assay）, ex vivo（3D神経浸潤モデル）, in vivo（同所移植モデル）での実験が一部施行できなかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
in vitro（invasion assay）, ex vivo（3D神経浸潤モデル）, in vivo（同所移植モデル）でのGSK3β阻害薬を含む各種リン酸化酵素阻害薬の効果を浸潤能、転移能において評価する。また、CRMP4ノックアウト膵癌マウスを完成させ、通常膵癌マウスと生存期間、腫瘍径、遠隔転移、神経浸潤を比較検討しCRMP4の膵癌進展における役割を詳細に解析する。
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[Journal Article] Metastatic Recurrence in a Pancreatic Cancer Patient Derived Orthotopic Xenograft (PDOX) Nude Mouse Model Is Inhibited by Neoadjuvant Chemotherapy in Combination with Fluorescence-Guided Surgery with an Anti-CA 19-9-Conjugated Fluorophore.2014
Author(s)
Hiroshima Y, Maawy A, Zhang Y, Murakami T, Momiyama M, Mori R, Matsuyama R, Katz MH, Fleming JB, Chishima T, Tanaka K, Ichikawa Y, Endo I, Hoffman RM, Bouvet M.
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Journal Title
PLoS One.
Volume: 2;9(12)
Pages: e114310
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Efficacy of tumor-targeting Salmonella typhimurium A1-R in combination with anti-angiogenesis therapy on a pancreatic cancer patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) and cell line mouse models.2014
Author(s)
Hiroshima Y, Zhang Y, Murakami T, Maawy A, Miwa S, Yamamoto M, Yano S, Sato S, Momiyama M, Mori R, Matsuyama R, Chishima T, Tanaka K, Ichikawa Y, Bouvet M, Endo I, Zhao M, Hoffman RM.
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Journal Title
Oncotarget.
Volume: 15;5(23).
Pages: 12346-57
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Efficacy of Salmonella typhimurium A1-R versus chemotherapy on a pancreatic cancer patient-derived orthotopic xenograft (PDOX).2014
Author(s)
Hiroshima Y, Zhao M, Maawy A, Zhang Y, Katz MH, Fleming JB, Uehara F, Miwa S, Yano S, Momiyama M, Suetsugu A, Chishima T, Tanaka K, Bouvet M, Endo I, Hoffman RM.
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Journal Title
J Cell Biochem.
Volume: 115(7)
Pages: 1254-61
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Successful fluorescence-guided surgery on human colon cancer patient-derived orthotopic xenograft mouse models using a fluorophore-conjugated anti-CEA antibody and a portable imaging system.2014
Author(s)
Hiroshima Y, Maawy A, Metildi CA, Zhang Y, Uehara F, Miwa S, Yano S, Sato S, Murakami T, Momiyama M, Chishima T, Tanaka K, Bouvet M, Endo I, Hoffman RM.
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Journal Title
J Laparoendosc Adv Surg Tech A.
Volume: 24(4)
Pages: 241-7
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] The tumor-educated-macrophage increase of malignancy of human pancreatic cancer is prevented by zoledronic acid.2014
Author(s)
Hiroshima Y, Maawy A, Hassanein MK, Menen R, Momiyama M, Murakami T, Miwa S, Yamamoto M, Uehara F, Yano S, Mori R, Matsuyama R, Chishima T, Tanaka K, Ichikawa Y, Bouvet M, Endo I, Hoffman RM.
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Journal Title
PLoS One.
Volume: 12;9(8)
Pages: e103382.
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Fluorescence-guided surgery with an anti-CA 19-9-conjugated fluorophore in combination with neoadjuvant chemotherapy inhibits metastatic recurrence in a pancreatic cancer patient derived orthotopic xenograft (PDOX) nude mouse model2015
Author(s)
Yukihiko Hiroshima1, Ali Maawy2, Yong Zhang3, Takashi Murakami4, Masashi Momiyama4, Ryutaro Mori4, Ryusei Matsuyama4, Matthew H. Katz5, Jason B. Fleming5, Takashi Chishima4, Kuniya Tanaka4, Yasushi ichikawa4, Itaru Endo4, Robert M. Hoffman6, Michael Bouvet2.
Organizer
米国癌学会（AACR annual meeting 2015）
Place of Presentation
Philadelphia、米国
Year and Date
2015-04-18 – 2015-04-22
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