2014 Fiscal Year Research-status Report
著明な骨量減少をきたすNedd4遺伝子欠損マウスの機能解析
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26462304
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
関本 朝久 宮崎大学, 医学部, 講師 (60305000)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
帖佐 悦男 宮崎大学, 医学部, 教授 (00236837)
黒木 修司 宮崎大学, 医学部, 医員 (40418843)
荒木 正健 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 准教授 (80271609)
荒木 喜美 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 教授 (90211705)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 遺伝子トラップ法 / ロコモティブシンドローム / 骨代謝異常 / Nedd4遺伝子 / モデルマウス / ノックアウトマウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、骨粗鬆症などのロコモティブシンドロームの病因・病態解明のために、『可変型遺伝子トラップ法』により樹立した変異マウス系統を用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子探索の効率的なスクリーニングを実施している。我々はそれらトラップクローンデータをデータベース『EGTC』(Database for the Exchangeable Gene Trap Clones, http://egtc.jp) に公開し、骨軟骨代謝に異常をきたす疾患モデルマウスライブラリーを構築中である。現在このEGTCデータベースに登録したクローンから、特に骨軟骨にトラップした遺伝子の発現のみられるクローンを選別し、その遺伝子欠損マウスを作製して骨軟骨表現型および遺伝子機能を解析している。
そのライブラリーマウスの中で、Nedd4 (neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated gene 4) 遺伝子欠損マウスは、骨軟骨スクリーニングにおいて著明な骨表現型異常を呈していた。しかしながら、これまでにNedd4遺伝子においてin vivoで骨代謝について報告例はない。ユビキチンリガーゼNedd4は多くの組織で発現している。これまで神経細胞、軟骨細胞の分化などに関与していることが報告されており、運動器全般の細胞分化や機能発現に関わっている可能性がある。
今回我々が可変型遺伝子トラップ法で作製したNedd4トラップマウスは、体が小さく、マイクロCT検査では骨量の減少を認め、骨代謝にも関与している可能性が非常に高い。本研究ではNedd4遺伝子欠損トラップマウスを用いて、その骨代謝における機能解析を目的としている。これまでの1次・2次スクリーニングの結果では、Nedd4は骨代謝において重要な機能を担っている可能性が考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在我々は『可変型遺伝子トラップ法』によって樹立されたトラップクローンを用いて、骨軟骨代謝に関与する新規遺伝子群の効率的なスクリーニングによる骨軟骨疾患モデルマウスライブラリー構築に取り組んでいる。
今回、前述のEGTCデータベースを用いてそのライブラリーマウスの骨/骨髄組織に発現する遺伝子を検索したところ、Nedd4遺伝子でESTプロファイルが高スコア(Nedd4：835：bone 557, bone marrow 278)を示した為、Nedd4遺伝子トラップクローンからホモ・ヘテロ接合体マウスを作製し、骨軟骨表現型をスクリーニングしている。
我々の作製したNedd4欠損トラップマウスにおいて、Nedd4遺伝子のvector insertion pointは、5'RACE法、インバースPCR法で解析を行い、第1イントロンであることを確認した。また、Trap vectorはゲノム上の1か所のみに挿入されていることを確認した。ヘテロマウスを用いた導入遺伝子の発現解析（X-gal染色）から、Nedd4は骨端線周囲海綿骨が染色され、骨組織を含む多くの組織に発現していた。遺伝子型を解析しえた個体の出生率は、野生型：1、ヘテロ型：1.46、ホモ型：0.21であった。Nedd4トラップマウスの体重は野生型の約65％であり、その後の成長で追いつくことはなく成長障害を認めた。また、Nedd4トラップマウスは短命であり、生存期間中央値は26日目で、自然死亡例の最長生存期間は33日だった。大腿骨を摘出しマイクロCT撮影を撮影すると、皮質骨の菲薄化や海綿骨の骨量減少を認めた。したがって、Nedd4は骨代謝において重要な機能を担っている可能性が高いと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
Nedd4はE3ユビキチンリガーゼのひとつであるが、これまで複数の研究機関でNedd4ノックアウトマウスが作製され、その機能解析が報告されている。IGF-1の低下とそれに伴うIGF-1 signalingの低下、胚の成長障害 (Cao, 2008)、T細胞の活性化 (Yang, 2008)、神経筋接合部の異常 (Liu, 2009)、心臓の発生、thrombospondin-1の抑制因子 (Fouladkou, 2010)、神経突起の形成 (Kawabe, 2010)などがノックアウトマウスや神経細胞のコンディショナルノックアウトマウスの胚組織や胚組織から採取した培養細胞を用いてなされてきた。しかしながら、これまで骨組織、骨代謝に言及した報告はない。
また、いずれの報告でもNedd4ノックアウトマウスは出生前に死亡すると報告されている。死因についても検討されているが、明らかにはなっていない。我々のNedd4トラップマウスに特徴的なことは、短命ではあるが生後一定期間生存することである。このためin vivoでの実験が可能であるというメリットがある。したがって、今後もNedd4遺伝子欠損トラップマウスを用いて、その骨代謝における機能を解析して行く計画である。既にNedd4欠損トラップマウスは骨軟骨1次スクリーニング (EST profile、X-gal染色) で骨表現型異常を呈していた為、今後は2次スクリーニング (マイクロCT、骨形態計測、骨力学試験、病理組織解析) を個体数や計測時期を増やして進めて行く計画である。
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