TGF-βとc-Mycの接点Myct1～その軟骨細胞分化・成熟における役割～

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462307
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 石堂 康弘 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 准教授 (10300740)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前田 真吾 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 准教授 (60353463) ; 小宮 節郎 鹿児島大学, 医歯学総合研究科, 教授 (30178371)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: MYCT1 / c-MYC / TGF-β / 軟骨肉腫

Outline of Annual Research Achievements

1) MYCT1遺伝子の発現プロファイリング
ヒト正常軟骨細胞C28/I2とその腫瘍(肉腫)カウンターパートであるヒト軟骨肉腫細胞株SW1353とHs 819.Tにおけるベースの発現と、TGF-β1(1ng/ml)で分化を誘導した際の発現を、定量的RT-PCR法(qRT-PCR)で評価・比較した。その結果、リガンド非刺激下のsteady-stateにおいて、MYCT1は軟骨肉腫細胞株で有意に2~3倍発現が高かった。興味深い事に、TGF-β1刺激によるMYCT1の発現増加率は軟骨肉腫細胞株SW1353において顕著であり、刺激後６日目においてC28/I2で約８倍の発現増加に対して、SW1353では約２６倍であった。Hs 819.TでもC28/I2と同等の7.3倍の増加があった。このTGF-β1刺激による軟骨肉腫細胞株におけるMYCT1の誘導は、ウエスタンブロットによって蛋白レベルでも証明された。TGF-β1刺激による経時的な発現動態の検討では、MYCT1はtime-dependentに増加する傾向にあった。
2) MYCT1発現誘導のメカニズム
MYCT1はc-MYCの標的遺伝子として知られているが、軟骨細胞系においてもこれが当てはまるのか、c-MYCのsiRNAを用いたノックダウン実験を行った。その結果、正常C28/I2細胞では顕著でなかったものの、SW1353細胞においては、c-MYCをノックダウンするとTGF-β1刺激によるMYCT1の発現増加が中程度抑えられた。このことは軟骨肉腫細胞におけるc-MYCの発現が3~4倍高い事を確認しているので、その分ノックダウンによる影響が肉腫細胞により強く出たと考えられた。この結果はqRT-PCRでもウエスタンブロットでも確認できた。
3) MYCT1の発現ベクター構築
MYCT1発現プラスミドは構築を終了し、アデノウイルス発現ベクター構築に着手している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

MYCT1発現動態やメカニズムの検討に着手し、一定の評価を出来ており、発現ベクター構築もほぼ順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

MYCT1の発現メカニズムについてシグナル抑制剤なども動員してより細かい検討を行う。またMYCT1の軟骨細胞や、軟骨肉腫細胞における分化度に対する役割を検討するために、MYCT1 siRNAによるノックダウンや、MYCT1発現アデノウイルスを用いた過剰発現実験を行い、分化度をマーカーのqRT-PCRやウエスタンブロットや、アルシアンブルーやALP等の基質染色で評価する。
MYCT1が軟骨肉腫の悪性度に影響を与える可能性を探るために、細胞増殖、運動、浸潤等の項目に対してsiRNAやアデノウイルス感染実験を行い、c-MYCと比較しながら検討する。
MYCT1遺伝子がTGF-β-Smad2/3経路の直接標的である可能性が疑われたら、Smad結合エレメントをMYCT1プロモーター上に検索した上で、Smad2/3抗体を用いたクロマチン免疫沈降法を行い検証する予定である。

Causes of Carryover

概ね使用計画通りに研究費執行が進んだが、年度末時点の研究状況で残額以下の額で急を要する必要経費はなかった事、また残額を超える単価の次年度に必要な試薬等に残額を充てる事で効率良く研究費を使用できると判断した為。

Expenditure Plan for Carryover Budget

残額分に関しては、それを超える単価の消耗品(siRNAやリアルタイムPCR試薬、リガンド類等)を翌年度分と併せて使用する予定である。

Research Products

• [Presentation] Myc Target 1 (MYCT1) Gene is a Novel Target of TGF-β Signaling to Promote Differentiation of Chondrosarcoma Cells (2015)
  • Author(s): Yahiro, Y; Maeda, S; Shinohara, N; Matsuyama, K; Kawamura, I; Setoguchi, T; Nagano, S; Yokouchi, M; Ishidou, Y; Komiya, S
  • Organizer: Orthopedic Research Society 2015 Annual Meeting
  • Place of Presentation: アメリカ合衆国、ラスベガス (MGM Grand Hotel)
  • Year and Date: 2015-03-28 – 2015-03-31