グリオスタチンは関節リウマチの新規治療ターゲットとなりうる

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462309
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 永谷 祐子 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90291583)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大塚 隆信 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (10185316) ; 浅井 清文 名古屋市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70212462)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 関節リウマチ / 滑膜細胞 / グリオスタチン / チミジンホスポリラーゼ / TNF alfa / マトリックスメタロプロテアーゼ

Outline of Annual Research Achievements

関節リウマチの病態にグリオスタチンが密接に関与していることを我々は初めて見いだし報告している。これまでの基礎研究成果に基づき、(1) 関節リウマチにおける関節破壊へのグリオスタチンの関与を解明すること、(2) GLS遺伝子の発現から関節炎惹起活性の発現に至る諸相を阻害することにより、関節リウマチの病勢を緩和する方法を確立することを最終目標としている。本研究では、関節リウマチ滑膜炎寛解のためグリオスタチンが治療のターゲットとなりえることを明らかにすることを目標とした。
本年度は、人工膝関節置換術の際に患者の承諾を得て採取した滑膜を培養し、形態学的に均一な線維芽細胞様滑膜培養細胞(FLSs)を用いた実験を施行した。FLSsにおいてグリオスタチン産生は、TNF-αによって誘導される。さらにグリオスタチンにはautocrine作用があり、これによりRA病態の慢性化、炎症の持続性が生じると考えられる。グリオスタチンによってmatrix metalloproteinases (MMPs)が誘導され、特にMMP-1、MMP-3、 MMP-9の誘導が顕著であった(RT-PCR法)。この誘導作用は、 Sp-1阻害剤にて著明に抑制された。ゼラチンザイモグラフィにてMMP-9の酵素活性も増強されることが明らかとなった。関節リウマチ患者血清中のグリオスタチン濃度を測定した。
TNF阻害薬治療経過において既存の血清病勢マーカー(CPR、赤沈、MMP-3)と比較してその推移を観察している。血清中のグリオスタチン濃度は滑膜炎のvolumeと相関するのではないかと示唆され、さらに症例を集積中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

交付申請書にてH27年度では、1. 滑膜細胞でのグリオスタチン産生におけるNF-κBシグナル伝達経路の検討、2. グリオスタチンRNA干渉(GLS siRNA)を用いた関節破壊の抑制、3. グリオスタチン産生阻害因子の検索の3点を目標とした。1.では、滑膜培養細胞でのグリオスタチン産生はTNF-αによって誘導されることからNF- κBシグナル伝達経路の関与が示唆された。そこでNF-κB阻害剤(dexamethasone、aspirinなど)を用いた実験系を構築した。グリオスタチン産生は抑制されたが、さらに詳細に検討するためNF-κB阻害剤の選択を再考すベきと考えた。Cycloheximide前処理をした後TNF-α刺激することによりグリオスタチン mRNAの誘導が完全に押さえられたことから、TNF-αによるグリオスタチン蛋白の誘導には何らかのタンパク質を介していると考えられたが今年度そのタンパク質を同定することはできなかった。2. GLS siRNAによるMMPsの産生抑制効果を判定した。3. グリオスタチン産生阻害因子ついては、今年度にさらに探索の範囲を広げる予定である。

Strategy for Future Research Activity

グリオスタチのプロモーターを組み込んだluciferase assay vectorを作製し、炎症性サイトカイン刺激によるグリオスタチン発現の転写調節活性部位を特定する。予備実験ではSp-１結合部位が重要であることが示唆されている。Sp-１阻害剤の一つであるmithramycinによりluciferase活性が高度に減弱することが確認できている(Ikuta K, et al. Arthritis Res Ther 2012; 14:R87)。より効率よくSp-１を阻害する薬剤をこの系を用いて検索する。近年臨床応用されているJanus kinase阻害剤についての予備実験で、Janus kinase阻害剤がSp-1阻害剤と同等のグリオスタチン抑制効果が得られることを確認した。その効果発現機序も明らかにしたい。
滑膜細胞ではグリオスタチンはautocrine 作用を有する。グリオスタチンautocrine作用の連鎖を断ち切る因子を明らかにすることで、生物学的製剤不応症例の病態抑制に迫れる可能性がある。

Causes of Carryover

26年度の研究実績を英語論文で発表予定であったが、論文作成が遅れ、次年度に持ち越した。そのため英文校正費と投稿費用をそれぞれ１０万円と８万円と想定し次年度に持ち越した。また各種シグナル伝達阻害剤の購入として約２０万円を想定していたが、一部実験協力者からの供与があったため次年度に持ち越しとなった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

次年度使用額については、平成28年6月ロンドンにおける国際学会(Annual European Congress of Rheumatology, 2016.6.8-11)において下記3演題が採択されたため、旅費として使用する予定である。1. The JAK inhibitor (Tofacitinib) inhibits TNF-induced gliostatin/thymidine phosphorylase expression in human fibroblast-like synoviocytes. 2. Sp1 interference prevents joint destruction of RA through inhibitory effects of gliostatin and matrix metalloproteinase-3. 3. Sp1 inhibitor modulates the autocrine action of gliostatin/thymidine phosphorylase (GLS/TYMP) in rheumatoid fibroblast-like synoviocytes.

Research Products

• [Journal Article] Postoperative evaluation of drill holes for arthroscopic Bankart repair with suture anchors by the use of computed tomography. (2015)
  • Author(s): Yoshida M, Goto H, Nozaki M, Nishimori Y, Takenaga T, Murase A, Nagaya Y, Iguchi H, Kobayashi M, Sugimoto K, Otsuka T.
  • Journal Title: J Orthop Sci Volume: 20 Pages: 481-487
  • DOI: 10.1007/s00776-015-0703-y
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Quantitative analysis of attachment of the labrum to the glenoid fossa: a cadaveric study. (2015)
  • Author(s): Yoshida M, Goto H, Nozaki M, Nishimori Y, Takenaga T, Murase A, Nagaya Y, Iguchi H, Kobayashi M, Sugimoto K, Nishiyama T, Otsuka T.
  • Journal Title: J Orthop Sci Volume: 20 Pages: 823-829
  • DOI: 10.1007/s00776-015-0742-4.
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] New Protocol to Optimize iPS Cells for Genome Analysis of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva. (2015)
  • Author(s): Matsumoto Y, Ikeya M, Hino K, Horigome K, Fukuta M, Watanabe M, Nagata S, Yamamoto T, Otsuka T, Toguchida J.
  • Journal Title: Stem Cells Volume: 33 Pages: 1730-1742
  • DOI: 10.1002/stem.1981
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Resveratrol suppresses TGF-β-induced VEGF synthesis in osteoblasts: Inhibition of the p44/p42 MAPKs and SAPK/JNK pathways. (2015)
  • Author(s): Kuroyanagi G, Otsuka T, Yamamoto N, Matsushima-Nishiwaki R, Kozawa O, Tokuda H.
  • Journal Title: Exp Ther Med Volume: 9 Pages: 2303-2310
  • DOI: 10.3892/etm.2015.2389
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Unphosphorylated HSP27 (HSPB1) regulates the translation initiation process via a direct association with eIF4E in osteoblasts. (2015)
  • Author(s): Kuroyanagi G, Tokuda H, Yamamoto N, Matsushima-Nishiwaki R, Kozawa O, Otsuka T
  • Journal Title: Int J Mol Med Volume: 36 Pages: 881-889
  • DOI: 10.3892/ijmm.2015.2274
  • Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] Sp1 interference prevents joint destruction of RA through inhibitory effects of gliostatin and matrix metalloproteinase-3. (2016)
  • Author(s): Ikuta K, Kawaguchi Y, Waguri-Nagaya Y, Tatematsu N, Kobayashi M, Goto H, Nozaki M, Aoyama M, Asai K, Otsuka T.
  • Organizer: Annual European Congress of Rheumatology (EULAR2016)
  • Place of Presentation: ExCel London, London, United Kingdom)
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-11
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Sp1 inhibitor modulates the autocrine action of gliostatin/thymidine phosphorylase (GLS/TYMP) in rheumatoid fibroblast-like synoviocytes. (2016)
  • Author(s): Tatematsu N, Waguri-Nagaya Y, Kawaguchi Y, Ikuta K, Kobayashi M, Goto H, Nozaki M, Aoyama M, Asai K, Otsuka T.
  • Organizer: Annual European Congress of Rheumatology (EULAR2016)
  • Place of Presentation: ExCel London, London, United Kingdom)
  • Year and Date: 2016-06-08 – 2016-06-11
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 関節リウマチ患者の血清 N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline(AcSDKP) 濃度は治療の有効性を反映している. (2016)
  • Author(s): 立松 尚衞, 永谷 祐子, 川口 洋平, 井之上 浩一, 浅井 清文, 大塚 隆信.
  • Organizer: 第89回日本整形外科学会学術集会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜, 横浜
  • Year and Date: 2016-05-12 – 2016-05-15
• [Presentation] トファシチニブ投与RA患者の臨床像と血清グリオスタチンへの影響の検討. (2016)
  • Author(s): 川口洋平, 永谷祐子, 立松尚衛, 小林正明, 後藤英之, 野崎正浩, 小栗雄介, 浅井清文, 大塚隆信.
  • Organizer: 第60回日本リウマチ学会総会・学術集会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜, 横浜
  • Year and Date: 2016-04-22 – 2016-04-24
• [Presentation] 関節リウマチ線維芽細胞様滑膜細胞においてTNF-によるグリオスタチン発現はJAK阻害剤により抑制される. (2015)
  • Author(s): 川口洋平, 永谷祐子, 立松尚衛, 小林正明, 後藤英之，野崎正浩, 青山峰芳, 浅井清文, 大塚隆信.
  • Organizer: 第30回日本整形外科基礎学術集会
  • Place of Presentation: 富山国際会議場, 富山
  • Year and Date: 2015-10-22 – 2015-10-23
• [Presentation] The inhibitory effect of synthetic disease-modifying anti-rheumatic drugs and steroids on gliostatin/platelet-derived endothelial cell growth factor production in human fibroblast-like synoviocytes. (2015)
  • Author(s): Kawaguchi Y, Waguri-Nagaya Y, Tatematsu N, Kobayashi M, Goto H, Nozaki M, Ikuta K, Aoyama M, Asai K, Otsuka T
  • Organizer: Annual European Congress of Rheumatology (EULAR2015)
  • Place of Presentation: Fiera Roma, Roma, Italy
  • Year and Date: 2015-06-10 – 2015-06-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] A Role For P38 Mitogen-Activated Protein Kinase (Mapk) In Gliostatin Production In Rheumatoid Fibroblast-Like Synoviocytes. (2015)
  • Author(s): Ikuta K, Kawaguchi Y, Waguri-Nagaya Y, Tatematsu N, Kobayashi M, Goto H, Nozaki M, Aoyama M, Asai K, Otsuka T.
  • Organizer: Annual European Congress of Rheumatology (EULAR2015)
  • Place of Presentation: Fiera Roma, Roma, Italy
  • Year and Date: 2015-06-10 – 2015-06-13
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] The JAK inhibitor (Tofacitinib) inhibits TNF-induced gliostatin/thymidine phosphorylase expression in human fibroblast-like synoviocytes. (2015)
  • Author(s): Kawaguchi Y, Waguri-Nagaya Y, Tatematsu N, Kobayashi M, Goto H, Nozaki M, Ikuta K, Aoyama M, Asai K, Otsuka T.
  • Organizer: Annual European Congress of Rheumatology (EULAR2016)
  • Place of Presentation: ExCel London, London, United Kingdom)
  • Year and Date: 2015-06-08 – 2015-06-11
  • Int'l Joint Research