2014 Fiscal Year Research-status Report
フィブロインと滑膜細胞、細切軟骨片を用いた一期的軟骨再生法確立のための基礎的研究
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26462322
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
中川 晃一 東邦大学, 医学部, 教授 (30400823)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中島 新 東邦大学, 医学部, 准教授 (60583995)
青木 保親 千葉大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (70584001)
齊藤 雅彦 東邦大学, 医学部, 助教 (30718747)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 軟骨再生 / 滑膜 / フィブロイン / ヒト |
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| Outline of Annual Research Achievements |
人工膝関節置換術を施行した患者（10名）より同意を得て滑膜組織を採取し、研究に使用しました。フィブロインスポンジ上に播種したヒト滑膜細胞を10% FBSおよび0.2 mM Asc2-P を添加した DMEM/F12培地にて2日間培養後、1% FBS, 1% ITS mix, 160μg/ml sodium pyruvate, 100 ng/ml dexamethasone, 0.2 mM Asc2-P を添加した DMEM/F12培地に変更し、さらに2週間培養しました。異なる細胞密度（2 million /ml, 10 million/ml, 50 million/ml）、フィブロインスポンジ孔径（平均50, 100, 200 micro m ）について検討しました。5ng/ml TGF beta-1 およびinsulin 添加群と非添加群とで比較をしたところ、アルシャンブルーによる染色, S100蛋白による免疫染色および生化学的検討で、いずれも明らかな差が認められませんでした。そこで、BMP2 200ng/mlを添加群と非添加群とで、比較を行いました。その結果、real-time RT-PCRによる解析で、軟骨分化のマーカーである Sox9、II型コラーゲン、アグリカンの遺伝子発現が BMP2添加群で有意に増加し、逆にI型コラーゲンの発現は有意に低下することが確認されました。組織学的検討では、アルシャンブルーによる染色でプロテオグリカンを含む軟細胞外基質の形成が部分的に認められ,、同部では免疫染色でS100蛋白の陽性の細胞の存在が確認されました。細胞密度は2 million /mlでも十分な差が認められ、またフィブロインスポンジ孔径は、平均100 micro m で最も大きな差が認められました。これらの結果より、ヒト滑膜細胞はフィブロインスポンジ内では BMP2存在下で軟骨への分化傾向を示すこと、細胞密度は2 million /mlで十分であること、フィブロインスポンジ孔径は平均100 micro m が指摘であることが明らかになりました。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト滑膜細胞をフィブロインスポンジ上に播種した場合は、以前行った micromass culture（高密度培養）と同じ培養条件（1% FBS, 1% ITS mix, 160μg/ml sodium pyruvate, 100 ng/ml dexamethasone, 0.2 mM Asc2-P を添加した DMEM/F12培地）では軟骨分化傾向が認められませんでしたが、BMP2を添加することで軟骨に分化することが確認できました。また、細胞密度は2 million /mlで十分であること、フィブロインスポンジ孔径は平均100 micro m が、軟骨への分化に指摘であることが明らかになりました。組織学的な検討では、十分な細胞基質産生は確認されていませんが、今後さらに条件（培養期間やBMP濃度など）を変えることで、改善が可能と考えられます。以上より「分離した滑膜細胞をフィブロインスポンジ上に播種し、軟骨分化条件の培養液にて培養して、滑膜細胞単独での軟骨分化能を試験管内で解析する。さらに滑膜細胞にとって至適なフィブロインスポンジ孔径と、細胞密度について検討を行う。」という初年度の目的は達成されたと考えます。
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| Strategy for Future Research Activity |
申請した予定通り、今後はフィブロインスポンジ上に播種したヒト滑膜細胞と細切軟骨組織片を試験管内で共培養した場合の軟骨分化促進効果について解析（27年度）し、さらに最適の条件下でヒト分離滑膜細胞と細切軟骨組織をフィブロインスポンジに播種した後、ヌードマウスの皮下に移植してその軟骨分化過程および周囲へのcell delivery効果について解析する（28年度）予定です。フィブロインスポンジ上でのヒト滑膜細胞の軟骨分化には、BMP2添加が必要であったことから、細切軟骨組織片との共培養の効果をみる実験においても、BMP2の存在下、非存在下の両者の条件を試します。フィブロインスポンジ上にヒト滑膜細胞を播種して12時間静置後に播種面が下になるようにTissue culture insert上にスポンジを置き、10% FBSおよび0.2 mM Asc2-P を添加した DMEM/F12 培地にて2日間培養、12時間無血清培地とした後、細切軟骨片を加えて共培養を行い、その効果を組織学的、生化学的に解析します。
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| Causes of Carryover |
研究分担者の一人が、当初予定していたよりも組織学的検査用の試薬の使用量が少なかったため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度直接経費の120万円は、全額消耗品として、ウシ胎児血清 20万、細胞培養様試薬・消耗品 25万、抗体試薬 15万円、組織消化用酵素 20万円、分子生物学的解析用試薬 25万円、組織染色用試薬・消耗品15万円 の内訳で使用予定でした。平成27年度に繰り越して使用することになった平成26年度分10万円は、組織染色用試薬・消耗品として使用いたします。これにより、平成27年度の組織染色用試薬・消耗品への予定使用額は当初予定分15万円と合わせて25万円となります。
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Research Products
(4 results)
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[Presentation] 広範囲関節軟骨欠損に対する骨髄刺激とフィブロイン被覆の併用療法の効果2014
Author(s)
齊藤雅彦, 中川晃一, 富田直秀, 玉田靖, 柴田孝史, 園部正人, 中島新, 高橋宏, 谷口慎治, 山田学, 平方栄一, 青木秀之, 齋藤知行
Organizer
第29回日本整形外科学会基礎学術集会
Place of Presentation
城山観光ホテル（鹿児島県鹿児島市）
Year and Date
2014-10-09 – 2014-10-10
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