胎児・胎盤特異的mRNA/microRNAの機能解析とその臨床応用に関する研究

2015 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462495
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 三浦 清徳 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(医学系), 准教授 (00363490)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 産婦人科 / 胎児 / 胎盤 / microRNA / 母体血漿 / C19MC / 基準値 / トランスクリプト－ム

Outline of Annual Research Achievements

目的：私どもは、平成26年度に、母体血漿中chromosome 19 microRNA cluster (C19MC)領域ならびにC14MC領域のmicroRNA流入量は、産科疾患あるいは異常妊娠と関連していることを報告した。そこで、平成27年度は、当初の計画通り、母体血漿中胎児・胎盤特異的microRNA（C19MCならびにC14MC)流入量の基準値はまだ明らかにするため、妊娠経過に伴うC19MCならびにC14MCmicroRNAの流入量を検討した。
対象と方法：本研究は倫理委員会の承認と妊婦の同意を得て実施された。正常妊婦を対象とし,妊娠11週,23週,30週,36週,産褥1日目および7日目に各々8例ずつ採血した。胎盤特異的microRNAとしてC19MC領域に存在するmiR518b,517a,517cおよび515-3pを,胎児特異的microRNAとしてC14MC領域に存在するmiR654-5p,323-3p,409-3pおよび370をターゲットとし,リアルタイムRT-PCR法で定量した。microRNAの内部コントロールとしてU6 snRNAを用いた。
結果：miR518b/miRu6の妊娠各週および産褥の中央値（最小値－最大値）は0.1446(0.08-0.33),0.2657（0.11-0.54）, 0.3849（0.24－2.45）, 0.6709（0.24-2.12）, 0.2796（0.17-0.60）, 0.1446（0.03－0.34）で、有意差を認めた（p＜0.01）。その他の胎盤特異的microRNAについても同様の結果で、妊娠経過に伴い上昇し、分娩後低下していた。miR654-5p/miRu6の中央値（最小値－最大値）はそれぞれ0.0291(0.01-0.59),0.539(0.01-0.35),0.0890(0.02-0.37), 0.1245(0.02-0.29), 0.2225(0.01-1.41), 0.819(0.00-0.50)であり、有意差は認めなかった（p＝0.558）。その他の胎児特異的microRNAについても同様の結果で、妊娠経過中に変化を認めなかった。
考察：母体血漿中胎児・胎盤特異的microRNAの流入量の推移は染色体領域によって異なることが明らかになり、それぞれの基準値に関する知見が得られた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り、H27年度は、母体血漿中の胎児・胎盤特異的mRNA/miRNA定量化における内部コントロールを決定し、妊娠経過に伴う母体血漿中胎児・胎盤特異的miRNA流入量の基準値を決定した。また、胎児・胎盤特異的トランスクリプトームからみた産科疾患の病態については、平成26年-27年度に査読のある複数の英文誌へ、その成果を報告している。以上より、本研究課題はおおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

平成28年度は以下のように研究を推進する。
１）発症前に採血したcfp-miRNA/標的遺伝子（mRNA）流入量と産科疾患との関連解析：
産科疾患（妊娠高血圧症候群、HELLP症候群、癒着胎盤および双胎間輸血症候群）それぞれ20例およびに妊娠週数をマッチさせた正常コントロール20例について産科疾患を発症する前に採血した血漿中の各産科疾患関連cfp-mRNA/miRNA流入量を定量する。両群間の流入量を比較解析して、産科疾患の発症と有意な相関を認めるcfp-mRNA/miRNAを産科疾患の発症を推定する分子マーカーとして同定するため、receiver operating characteristic (ROC) 解析を行う（Robin X　et al.BMC Bioinformatics 2011）。
2)胎児・胎盤機能あるいは将来的な産科疾患発症の推定に有用な胎児・胎盤由来mRNA/microRNA分子マーカーセットを同定し、臨床応用の可能性を探る：単独マーカーと比較して、発症前の母体血漿中胎児・胎盤由来mRNA/microRNA流入量の定量で産科疾患と正常妊娠とを有意差を持って高精度に推定しうる分子マーカーセットを同定するため、ROC 解析を行う。胎児超音波所見と分子マーカーセットとの併用などによる将来的な産科疾患発症の推定や胎児・胎盤機能の評価への臨床応用の可能性を検討する。
3)胎盤由来の細胞を用いて、胎児・胎盤特異的microRNAの発現抑制ならびに過剰発現実験を行い、胎児・胎盤特異的microRNAの生物学的意義に関する知見を得る。

Causes of Carryover

次年度使用額が生じた理由は、以下の2点です。
１）平成7年度も胎児・胎盤特異的microRNAと産科疾患との関連解析ならびに母体血漿中の流入量の基準値の決定に取り組みました。そこで、平成26年度に予定していた細胞内へのターゲットmicroRNAのアンチセンス導入を実施しなかったので、使用を予定していた細胞へのアンチセンス導入に使用する実験キットの新規購入を行わなかったため、次年度使用額が生じました。
２）また、１）に関連して、細胞を用いた実験に必要な消耗品を購入しなかったので、次年度使用額が生じました。

Expenditure Plan for Carryover Budget

研究期間内の研究計画は、順調に進捗しており、平成28年度は、胎盤由来の細胞を用いて、胎児・胎盤特異的microRNAを発現抑制ならびに過剰発現させる実験を行います。したがって、細胞へのアンチセンス導入に使用する実験キットならびに消耗品類を購入するので、研究期間内に計画通りに研究費は使用されます。

Research Products

• [Journal Article] A significant association between rs8067378 at 17q12 and invasive cervical cancer originally identified by a genome-wide association study in Han Chinese is replicated in a Japanese population (2016)
  • Author(s): Miura K, Mishima H, Yasunami M, Kaneuchi M, Kitajima M, Abe S, Higashijima A, Fuchi N, Miura S, Yoshiura K, Masuzaki H
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 61 Pages: 793-796
  • DOI: 10.1038/jhg.2016.50
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Fetal cell-free DNA fraction in maternal plasma is affected by fetal trisomy (2016)
  • Author(s): Suzumori N, Ebara T, Yamada T, Samura O, Yotsumoto J, Nishiyama M, Miura K, Sawai H, Murotsuki J, Kitagawa M, Kamei Y, Masuzaki H, Hirahara F, Saldivar JS, Dharajiya N, Sago H, Sekizawa A; Japan NIPT Consortium
  • Journal Title: Journal of Human Genetics Volume: 61 Pages: 647-652
  • DOI: 10.1038/jhg.2016.25
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Survey of prenatal testing for genetic disorders in Japan: Recent report (2016)
  • Author(s): Nobuzane T, Yamada T, Miura K, Sawai H, Masuzaki H, Kudo Y
  • Journal Title: The Journal of Obstetrics and Gynaecology Research Volume: 42 Pages: 375-379
  • DOI: 10.1111/jog.12948
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Adult T-cell leukemia-lymphoma in a pregnant woman diagnosed as a human T-cell lymphotropic virus type 1 carrier (2016)
  • Author(s): Fuchi N, Miura K, Imaizumi Y, Hasegawa H, Yanagihara K, Miyazaki Y, Masuzaki H
  • Journal Title: The Journal of Obstetrics and Gynaecology Research Volume: 42 Pages: 336-340
  • DOI: 10.1111/jog.12904
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Association of maternal pre-pregnancy weight, weight gain during pregnancy, and smoking with small-for-gestational-age infants in Japan (2016)
  • Author(s): Akahoshi E, Arima K, Miura K, Nishimura T, Abe Y, Yamamoto N, Oishi K, Masuzaki H, Aoyagi K
  • Journal Title: Early Human Development Volume: 92 Pages: 33-36
  • DOI: 10.1016/j.earlhumdev.2015.10.022
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Estrogen deficiency heterogeneously affects tissue specific stem cells in mice (2015)
  • Author(s): Kitajima Y, Doi H, Ono Y, Urata Y, Goto S, Kitajima M, Miura K, Li TS, Masuzaki H
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 5 Pages: 12861
  • DOI: 10.1038/srep12861
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Increased levels of cell-free miR-517a and decreased levels of cell-free miR-518b in maternal plasma samples from placenta previa pregnancies at 32 weeks gestation (2015)
  • Author(s): Hasegawa Y, Miura K, Higashijima A, Abe S, Miura S, Yoshiura KI, Masuzaki H
  • Journal Title: Reproductive Sciences Volume: 22 Pages: 1569-1576
  • DOI: 10.1177/1933719115589407
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Circulating levels of C19MC-cluster microRNAs in pregnant women with severe pre-eclampsia. (2015)
  • Author(s): Miura K, Higashijima A, Murakami Y, Tsukamoto O, Hasegawa Y, Abe S, Naoki Fuchi N, Miura S, Kaneuchi M, Masuzaki H
  • Journal Title: The Journal of Obstetrics and Gynaecology Research Volume: 41 Pages: 1526-1532
  • DOI: 10.1111/jog.12749
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Pregnancy-associated microRNAs in plasma as potential molecular markers of ectopic pregnancy (2015)
  • Author(s): Miura K, Higashijima A, Mishima H, Miura S, Kitajima M, Kaneuchi M, Yoshiura KI, Masuzaki H
  • Journal Title: Fertility and Sterility Volume: 103 Pages: 1202-1208
  • DOI: 10.1016/j.fertnstert.2015.01.041
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Circulating levels of maternal plasma cell-free miR-21 are associated with maternal body mass index and neonatal birth weight (2015)
  • Author(s): Miura K, Higashijima A, Hasegawa Y, Abe S, Miura S, Fuchi N, Murakami Y, Kinoshita A, Yoshida A, Kaneuchi M, Yoshiura KI, Masuzaki H
  • Journal Title: Prenatal Diagnosis Volume: 35 Pages: 509-511
  • DOI: 10.1002/pd.4509
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Effect of labor on plasma concentrations and postpartum clearance of cell-free, pregnancy-associated, placenta-specific microRNAs (2015)
  • Author(s): Morisaki S, Miura K, Higashijima A, Abe S, Miura S, Hasegawa Y, Yoshida A, Kaneuchi M, Yoshiura KI, Masuzaki H
  • Journal Title: Prenatal Diagnosis Volume: 35 Pages: 44-50
  • DOI: 10.1002/pd.4479
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Presentation] 出生前診断 (2015)
  • Author(s): 三浦清徳
  • Organizer: 第115回九州医師会医学会 第3分科会
  • Place of Presentation: 長崎県医師会館、長崎
  • Year and Date: 2015-11-15 – 2015-11-15
  • Invited
• [Presentation] 胎盤特異的microRNAの同定とその臨床的意義 (2015)
  • Author(s): 三浦清徳、増崎英明
  • Organizer: 第23回日本胎盤学会学術集会
  • Place of Presentation: JA共済ビルカンファレンスホール、東京
  • Year and Date: 2015-11-05 – 2015-11-06
  • Invited
• [Presentation] Pregnancy-associated microRNAs in plasma as potential molecular markers of ectopic pregnancy (2015)
  • Author(s): Kiyonori Miura, Ai Higashijima , Yuri Hasegawa, Shoko Miura, Atsushi Yoshida, Masanori Kaneuchi, and Hideaki Masuzaki
  • Organizer: The 19th International Conference on Prenatal Diagnosis and Therapy
  • Place of Presentation: Washington DC, USA
  • Year and Date: 2015-07-12 – 2015-07-15
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 出生前遺伝学的検査 (2015)
  • Author(s): 三浦清徳、増﨑英明
  • Organizer: 第51回日本周産期・新生児医学会学術集会
  • Place of Presentation: ヒルトン福岡シーホーク、福岡
  • Year and Date: 2015-07-10 – 2015-07-12
  • Invited
• [Presentation] 日本におけるNIPTの現状 (2015)
  • Author(s): 三浦清徳、増崎英明
  • Organizer: 第62回日本小児保健協会学術集会
  • Place of Presentation: 長崎ブリックホール、長崎
  • Year and Date: 2015-06-18 – 2015-06-20
  • Invited
• [Remarks] 長崎大学病院産婦人科
  • URL: http://www.med.nagasaki-u.ac.jp/gyneclgy/