2014 Fiscal Year Research-status Report
婦人科癌におけるテロメラーゼ活性化機転に基づく末梢血腫瘍細胞の検出・解析法の確立
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26462516
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
高倉 正博 金沢大学, 大学病院, 准教授 (20313661)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藤原 浩 金沢大学, 医学系, 教授 (30252456)
京 哲 島根大学, 医学部, 教授 (50272969)
尾崎 聡 金沢大学, 保健学系, 助教 (40401921)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 末梢血中腫瘍細胞 / テロメラーゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
末梢血中腫瘍細胞(CTC)はいくつかの癌種において予後マーカーと成りうることが示されているが、その測定法や解釈などはいまだに発展途上である。現在のCTC測定法は細胞表面の上皮特異抗原を検出するものが主流であるが、本研究では発想を転換し、癌特異的におこる不死化関連酵素テロメラーゼの活性化に着目し、テロメラーゼが活性化された細胞でのみ増殖可能な改変型アデノウイルス（Telomerase-specific replication-selective adenovirus）を用いた新しいCTC測定法を確立した。本研究はこれを用いて婦人科癌におけるCTCの臨床的意義を解明するとともに、CTCの単離と遺伝子変異解析を確立することで、癌の転移機構の解明につなげることを目的としている。
(1) TRAD-GFPを用いたCTC検出方法の改良とその臨床的意義の解明
TRAD-GFPの感染効率をさらに向上させるためにCAR(coxsackievirus and adenovirus receptor)非依存的アデノウイルスベクターを研究協力者であるオンコリスバイオファーマと共同開発し、子宮頸がんにおけるCTCを臨床検体で検討した。CTC陽性率は約40％であった。
(2) CTCの単離方法の確立とその遺伝子解析
微小ピペットを用いて検出したCTCを単離することに成功した。回収したCTCのゲノムDNAをwhole genome amplification法で増幅し遺伝子解析を行った。本研究では原発巣子宮頸がん患者を対象としてCTCでHPV DNAのPCRを行い、原発巣と一致した型のHPV DNAが存在することを示した。これによって一個のCTCからの遺伝子解析が可能であることを示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①改良型TRAD-GFPの開発とCTC検出法の最適化：CAR非依存的ベクター（OBP1101）を作成した。癌細胞株をもちいたin vitroの検討では従来のベクターに比べてCAR発現の少ない細胞株での感染率の向上が認められた。これを踏まえて臨床検体でのCTC検出実験に着手することができた。
②婦人科癌患者におけるCTCの測定：2014年度は子宮頸がん患者おけるCTCの測定を試験的に行った。CTCの陽性率は40％であった。今後、さらに症例の集積が必要であると考えられた。
③CTC単離方法の確立：PicoPipetにて蛍光顕微鏡下でのGFP陽性細胞の単離に培養細胞を用いた系を稼働させ、90％以上の効率でCTCを回収することに成功した。
④CTCにおけるDNA変異解析：単一細胞をwhole genome amplification後、PCR増幅、シークエンシングを行った。外来遺伝子としてのHPV DNAの存在確認には成功している。PTEN、P53、PIK3CAといった頻度の高い遺伝子異常に関してはprimerセットを用意しPCR条件等をプロトコール化し、検出が用意にできる環境を整備している。
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| Strategy for Future Research Activity |
①婦人科癌患者におけるCTCの測定：引き続き臨床検体でのCTC測定を行い、データーを蓄積する（担当：高倉）。得られたデーターは臨床病理学的な因子との関連性、予後との相関について検討し、婦人科癌におけるCTCのバイオマーカーとしての臨床的意義を明らかにする。
②CTCにおけるDNA変異解析：臨床検体におけるCTC単離とそれに引き続いたCTCの遺伝子解析を子宮頸がんをはじめ他癌種でも検討を行う。複数の癌既往がある患者の遠隔再発等、原発巣の判断に苦しむ症例での診断においても有用な可能性があり、応用の範囲を拡げたい。検出結果が不十分な場合はウイルスベクターの再改良も含めて対策を探る。
③CTCにおける遺伝子発現解析：血中に侵入した癌細胞のすべてが転移性病変を作る訳ではない。それがCTCの量的問題であるのか質的問題であるのかには明らかな答えは得られていない。CTCの遺伝子発現状態を調べることで、血管内に侵入した癌細胞に起こっている変化を解明できる。これにより転移を起こすCTCと起こさないCTCが区別できるようになるかもしれない。また、癌がいかに転移を起こすのかという大問題への答えの端緒となる可能性もある。CTCから得られた微量のcDNAはPCRベースに一旦増幅されてから、目的のアッセイに供する。第一の目標は細胞1個という究極の微小検体からその後の解析に耐える質の高いcDNAを得ることである。原発巣のcDNAが入手可能であればDNAマイクロアレイによる遺伝子発現状況の比較が可能である。
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| Causes of Carryover |
CTCの遺伝子解析が順調に推移したため、当初推定していたよりも試薬の使用量などが少なく経費がかからなかったためと考えられる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
CTCの遺伝子変異解析に関して本学に今年度より次世代シーケンサーが導入されたため、これを使用することを考慮している。そのための経費として使用することが想定されている。
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Research Products
(3 results)
