2014 Fiscal Year Research-status Report

Toll様受容体アゴニストを用いた上気道粘膜免疫誘導と機序の解明

Research Project

Project/Area Number	26462585
Research Institution	Oita University
Principal Investigator	鈴木正志大分大学, 医学部, 教授 (60211314)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	門脇嘉宣大分大学, 医学部, 助教 (10706980) 平野隆大分大学, 医学部, 講師 (20305056)
Project Period (FY)	2014-04-01 – 2017-03-31
Keywords	中耳炎ワクチン / インフルエンザ菌 / 粘膜アジュバント
Outline of Annual Research Achievements	外来微生物に対する生体防御機構において自然免疫および獲得免疫の関与は非常に重要である。monophosphoryl lipid A (MPL)は TLR4 agonistの１つであり、全身免疫としてのワクチンアジュバントとして実際の臨床に応用されている。今回、我々はMPLを粘膜アジュバントとして用いて鼻咽腔粘膜局所における獲得免疫応答が誘導されるかどうか検討している。実験動物はSPF下にて飼育した、雄性、 6週令、BALB/cマウスを用いた。ワクチン抗原として無莢膜型インフルエンザ菌strain76から抽出した外膜蛋白（OMP）10μgを用いている。人工合成したMPLを粘膜アジュバントとして使用した溶液を10μlづつ週１回計３回経鼻免疫を行った。マウスを４群に分け、１群は対照としてリン酸緩衝液（PBS）投与し、２群はOMP投与のみ、３群はOMP とMPL 10μgを、４群はOMPとMPL 20μgをマウスに経鼻投与している。経鼻免疫後にインフルエンザ菌溶液（107cfu/mouse）を経鼻投与行い、投与後６、１２時間後に鼻咽腔洗浄液を採取し、鼻腔洗浄液中のインフルエンザ菌生菌数を計測した。OMP特異的抗体価測定をELISA法にて鼻腔洗浄液中、血清中のOMP特異的抗体価を測定した。インフルエンザ菌の鼻咽腔クリアランスは、対照群と比較してMPL投与群では促進しており、MPL投与群において鼻腔洗浄液についてはOMP特異的IgA、血清ではOMP特異的IgGの上昇が認められた。また、鼻腔洗浄液中のOMP特異的IgA値と血清中OMP特異的IgGは、鼻咽腔クリアランスと有意な相関関係を認めた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ワクチン投与マウスにおいて、対照としたリン酸緩衝液（PBS）投与のみならず、OMP投与マウスと比較しても、粘膜アジュバントとしてMPL 10μg、およびMPL 20μg投与マウスにでは、粘膜免疫応答がより強固に惹起されていることが判明したため、概ね順調に進展している。
Strategy for Future Research Activity	MPL経鼻投与における粘膜免疫応答の検証を行う。次にMPLと共にOMP/P6経鼻ワクチン投与モデルに対して、中耳炎粘膜、鼻粘膜、肺組織、唾液腺、腸管粘膜、NALT　頸部リンパ節、脾臓など粘膜およびリンパ組織における樹状細胞の活性化、T細胞の相互作用についてCD3,CD4, CD8, CD11c, CD123など各単核球マーカーのみならずCD40,CD80,CD86等の補助機能分子など各種表面マーカーを用いて、それぞれの細胞の粘膜組織における動態や活性化について対照マウスと比較検討を行う。樹状細胞においてはplasmatoidおよびmyeloid typeまたセルソーターを用いて、各種粘膜組織における様々なヘルパーT細胞、細胞障害性T細胞、制御性T細胞、Th17細胞などを分離採取のちに、各粘膜組織とくに鼻粘膜におけるサイトカイン、ケモカインなど各種mRNAレベルにおいて発現動態についても検討を行う。また、免疫組織学的検討や共焦点レーザー顕微鏡による組織学的検討も含めて樹状細胞やリンパ球における免疫学的動態について検討を行う。
Causes of Carryover	マウスを用いた検討を行っており、Flowcytometryによる解析やBioplex cytokine assay などの追加の実験を今後もする予定ではあるが、実験にはまとまった試料が必要であり、現在、試料採取を継続している状態である。その分の検討が次年度に持ち越されるために、残額が生じている。
Expenditure Plan for Carryover Budget	今後は、マウスの各種リンパ組織からのflowcytometric analysisを樹状細胞のみならず、T,B細胞含めて検討する予定であり、マウス鼻腔および血清のみならず、樹状細胞の培養実験において上清を含めてBioplex cytokine assay を行う予定にしている。