2014 Fiscal Year Research-status Report
CCN2による骨細胞機能を標的とした新規骨粗鬆症治療薬の開発
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26462810
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
西田 崇 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (30322233)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
滝川 正春 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (20112063)
久保田 聡 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (90221936)
服部 高子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (00228488)
青山 絵理子 岡山大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (10432650)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | CCN2/CTGF / 骨細胞 / マウス骨細胞株MLO-Y4 / 破骨細胞形成 / 3次元培養 / 薬剤誘導性Ccn2欠損マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題の目的は骨リモデリングの司令塔的役割を担う骨細胞に対するCCN family protein 2/結合組織成長因子(CCN2/CTGF)の役割を骨細胞による破骨細胞形成への影響の観点から解析し、新規骨粗鬆症治療薬としての可能性を検討することである。平成26年度は主にマウス骨細胞様細胞株であるMLO-Y4細胞を用いてin vitroにおけるCCN2の作用を明らかにした。(1)単層培養したMLO-Y4細胞は星状の形態を示したが、生体で見られる様な長い突起形成は見られなかった。そこで、コラーゲンゲル内で3次元培養したところ、細胞間に長い突起形成が見られ、より生体内に近い形態を示した。よって、CCN2の機能解析はMLO-Y4細胞を主に3次元で培養して行った。(2) 組換えCCN2タンパク質(rCCN2)でMLO-Y4細胞を刺激すると、Ccn2の遺伝子発現レベルと骨細胞マーカーの一つであるSostの遺伝子発現レベルが上昇した。(3) MLO-Y4細胞に超音波刺激を加えると、Ccn2及びSost遺伝子の発現レベルの上昇が見られた。(4) 3次元培養したMLO-Y4細胞上にマウスマクロファージ系細胞株RAW264.7を播種し、GST融合RANKL (GST-RANKL)で破骨細胞形成を誘導すると、rCCN2を添加したMLO-Y4細胞培養系で破骨細胞形成に必須な転写因子であるNFATc1の産生量の増加が見られた。(5) CCN2の老齢期マウスの骨細胞への影響を解析するために、京都大学から供与されたCCN2flox/floxマウスとJackson labから購入したCAG-CreER transgenicマウスを交配し、タモキシフェンによって誘導できるCcn2欠損マウスを作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成26年度の研究目的は本課題に適したMLO-Y4細胞の培養条件の検討とその培養条件によるCCN2の作用を明らかにすることであるため、MLO-Y4細胞の3次元培養の確立とCCN2刺激されたMLO-Y4細胞によるRAW264.7細胞の破骨細胞形成に対する促進作用を明らかにしたことにより、概ね順調に進展していると考えられる。また、タモキシフェン誘導性Ccn2欠損マウスの作製に成功しており、この点からも本課題は順調に進展している。しかしながら、平成27年度に予定している実験を遂行するためには上記マウスの匹数が十分ではないので、まず、タモキシフェン誘導性Ccn2欠損マウスの匹数を増やす必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成27年度から昨年度作製した薬剤誘導性Ccn2欠損マウスを長期飼育し始める。平成27年度では、この内の3ヶ月齢のマウスを使って、生後3ヶ月後にタモキシフェンをマウスに投与する。タモキシフェン投与によってCCN2が欠失するので、マウスを安楽死後、大腿骨及び脛骨を採取し、骨組織中の骨量や骨密度がどのような影響を受けているかをマイクロCTや組織化学的手法により検討する。また、タモキシフェンを投与した薬剤誘導性Ccn2欠損マウスの大腿骨から骨細胞を単離し、3次元培養する。3次元培養上に同じマウスから採取した骨髄細胞を播種し、破骨細胞に誘導させた時に破骨細胞形成がどのような影響を受けるのかを検討する。平成27年度以降、薬剤誘導性Ccn2欠損マウスは老齢期まで飼育を継続し、平成28年度以降の解析に備える。
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| Causes of Carryover |
当初予定として平成27年度から薬剤誘導性Ccn2欠損マウスを用いたin vivo解析を始める予定であったが、平成26年度は薬剤誘導性Ccn2欠損マウスの作製までであり、in vivo実験を遂行するだけの匹数の確保までは進展できなかった。そのため、薬剤誘導性Ccn2欠損マウスの繁殖と維持に使用予定であった金額が余剰した。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度は早急に薬剤誘導性Ccn2欠損マウスの繁殖を行い、実験条件にあったマウスを確保し、薬剤誘導性Ccn2欠損マウスを用いたin vivo解析を開始する予定であり、平成27年度に請求する研究費と当該研究費を合わせて研究計画を実施する予定である。
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[Journal Article] CCN family protein 2 (CCN2) promotes the early differentiation, but inhibits the terminal differentiation of skeletal myoblasts.2015
Author(s)
Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E.,Janune, D., Lyons, K.M., Takigawa, M.
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Journal Title
J Biochem.
Volume: 157
Pages: 91-100
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Direct interaction between CCN family protein 2 and fibroblast growth factor 1.2014
Author(s)
Abd El Kader, T., Kubota, S., Anno, K., Tanaka, S., Nishida, T., Furumatsu, T., Aoyama, E., Kuboki, T., Takigawa, M.
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Journal Title
J. Cell Commun. Signal.
Volume: 8
Pages: 157-163
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Differential expression of vascular endothelial growth factor in high- and low- metastasis cell lines of salivary gland adenoid cystic carcinoma.2014
Author(s)
Kondo, S., Mukudai, Y., Soga, D., Nishida, T., Takigawa, M., Shirota, T.
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Journal Title
Anticancer Res.
Volume: 34
Pages: 671-677
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] CCN2 as a novel molecule supporting energy metabolism of chondrocytes.2014
Author(s)
Maeda-Uematsu, A., Kubota, S., Kawaki, H., Kawata, K., Miyake, Y., Hattori, T., Nishida, T., Moritani, N., Lyons, K. M., Iida, S. and Takigawa, M.
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Journal Title
J. Cell Biochem.
Volume: 115
Pages: 854-865
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] The regenerative effects of CCN2 independent modules on chondrocytes in vitro and osteoarthritis models in vivo.2014
Author(s)
Abd El Kader, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Hara, E. S., Ono, M., Tabata, Y., Kuboki, T., Takigawa, M.
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Journal Title
Bone
Volume: 59
Pages: 180-188
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] E6-AP/UBE3A Protein, a Ubiquitin Ligase toward SOX9 Protein is essential to endochondral ossification.2015
Author(s)
Hattori, T., Kishino, T., Stephen, S.,Eberspaecher, H., Maki, S., Takigawa, M., Nishida, T., Kubota, S., de Crombrugghe, B., Yasuda, H.
Organizer
Gordon Research Conference, Cartilage Biology &Pathology
Place of Presentation
Galveston, TX, USA
Year and Date
2015-03-22 – 2015-03-27
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[Presentation] Assessment of the regenerative effects of CCN2 independent modules on chondrocytes in vitro and osteoarturiritis models in vivo.2014
Author(s)
Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E., Janune, D., Hara, E. S., Ono, M., Tabata, Y., Kuboki, T., Takigawa, M.
Organizer
第37回日本分子生物学会
Place of Presentation
横浜
Year and Date
2014-11-25 – 2014-11-27
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[Presentation] The regenerative effect of CCN2 independent modules on chondrocytes in vitro and osteoarturiritis models in vivo.2014
Author(s)
Abd El Kdaer, T., Kubota, S., Nishida, T., Hattori, T., Aoyama, E.,Janune, D., Hara, E. S., Ono, M., Tabata, Y., Kuboki, T., Takigawa, M.
Organizer
第6回CCNファミリー研究会
Place of Presentation
岡山
Year and Date
2014-08-30 – 2014-08-30
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[Presentation] LIPUS promotes CCN2-mediated cartilage matrix gene expression via MAPK pathways.2014
Author(s)
Nishida, T., Kubota, S., Aoyama, E., Yamanaka, N., Takigawa, M.
Organizer
92nd IADR
Place of Presentation
Cape Town, South Africa
Year and Date
2014-06-25 – 2014-06-28
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