2014 Fiscal Year Research-status Report
KLF依存性細胞分化‐EMT誘導因子の同定と口腔癌進行抑制効果の解析
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26462859
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| Research Institution | The Nippon Dental University |
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Principal Investigator |
今井 一志 日本歯科大学, 生命歯学部, 教授 (10328859)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
須藤 遙 日本歯科大学, 生命歯学部, 講師 (20372980)
千葉 忠成 日本歯科大学, 生命歯学部, 准教授 (60350138)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | KLF / 口腔癌 / 転写因子 / プロモーター / Sp1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
KLF5は口腔癌細胞の分化を抑制する転写因子であり、KLF5発現の異常が口腔癌の進展に大きな役割を果たす可能性を明らかにした。そこで、ヒトKLF5遺伝子のプロモーター領域とエクソン１の一部を含むDNAフラグメント（-2,001～+424 bp）をBACクローンから単離し、様々長さをもつ10種類の断片をPCRで増幅し、ルシフェラーゼアッセイ用レポータープラスミドにクローニングした。断片のDNA配列に変異がないことを確認後、293T細胞とHSC2口腔癌細胞にプラスミドを導入し、24 h後のルシフェラーゼ活性を測定するデュアルレポーターアッセイを行った。その結果、KLF5発現に不可欠な必要最小領域は+145～+331 bpの187 bpに限定された。転写因子結合配列をデータベース検索したところ、この領域には６か所のGCボックス（Sp1結合配列）と１か所のCACCC配列（KLF結合配列）が存在した。KLF4あるいはKLF5のcDNAとレポータープラスミドを同時に導入してもルシフェラーゼ活性には変化が見られなかったことから、Sp1の関与が疑われた。そこで、GCボックスのそれぞれに変異をもつミュータントプラスミド（mGC1～mGC6）を作製しレポーターアッセイを行った結果、+129～+142（mGC1）あるいは+299～+312（mGC6）がKLF5発現を大きく低下させ、特にmGC1ではルシフェラーゼ活性が80.5%減少した。従って、ヒトKLF5遺伝子の発現はSp1による制御が重要と考えられる。今後、クロマチン免疫沈降実験等を行い、多角的にその重要性を検証する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度（平成26年度）に設定した計画はKLF遺伝子のプロモーター解析であり、その目的はほぼ達成された。
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| Strategy for Future Research Activity |
クロマチン免疫沈降法等による解析を追加した後、速やかに学術雑誌に投稿する予定でいる。2年目（平成27年度）以降は、KLFにより細胞外に分泌される液性因子を単離精製・同定し、口腔癌細胞の表現型（特に分化形質）に与える作用を明らかにする。
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Research Products
(4 results)
