高齢者の異時性口腔癌制御を目的とした血管新生阻害剤局所注入療法の確立

2016 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26462999
• Research Institution: University of Fukui
• Principal Investigator: 佐野 和生 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (20145270)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2018-03-31
• Keywords: 口腔癌 / 扁平上皮癌 / 血管新生阻害剤 / 背部皮下移植 / ヌードマウス

Outline of Annual Research Achievements

高齢者の異時性口腔癌制御を目的として、血管新生阻害剤を用いた局所注入療法について口腔扁平上皮癌ヌードマウス背部皮下移植モデルを用いた実験的検討を行った。まず、九州大学口腔病理学教室より供与を受けた口腔扁平上皮癌細胞株の細胞培養、細胞の分子生物学的特徴の解析を行った。ベバシズマブはVEGF-Aに結合して血管新生を抑制するため、ヌードマウスに口腔扁平上皮癌株を移植する前に、移植する口腔扁平上皮癌細胞株にVEGF-Aが発現しているか、mRNAレベルで口腔扁平上皮癌細胞株におけるVEGF-Aの発現量をreal-time PCRにより解析した。ヒト角化細胞HakaTをコントロールとして使用し、口腔扁平上皮癌細胞株としてHSC-2、HSC-3、HSC-4、MISK81-5、SASを用いた。すべての細胞でVEGF-Aの発現が確認できた。その中でもHSC-3においてVEGF-Aの発現量が最も高かった。そこで、HSC-3をヌードマウスに移植し、ベバシズマブ投与前の予備実験を開始した。ヌードマウス癌背部移植モデルを作製し、HE染色による組織学的評価、Ki-67免疫染色による腫瘍細胞の検討を行ったところ、腫瘍細胞の密度が予期したものより低いため、以降、細胞密度を高める目的で詳細な検討を行う必要が生じた。
平成28年度には腫瘍細胞密度の高いヌードマウス癌背部移植モデルを作製できたため、対照群、血管新生阻害剤局所注入療法群を含めた実験を行った。標本摘出後、パラフィン切片を作製し、CD31による微小血管の免疫染色、TUNNEL法による染色を行った。
舌への癌移植モデルについては、予備実験で50％の生着率であったため、100％にすべく再度予備実験を行う予定である。また、舌において実験に適した移植部位の検討も行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ベバシズマブはVEGF-Aに結合して血管新生を抑制するため、ヌードマウスに口腔扁平上皮癌株を移植する前に、移植する口腔扁平上皮癌細胞株にVEGF-Aが発現しているか、mRNAレベルで口腔扁平上皮癌細胞株におけるVEGF-Aの発現量の解析を行った。ヒト角化細胞HakaTをコントロールとして使用し、口腔扁平上皮癌細胞株としてHSC-2、HSC-3、HSC-4、MISK81-5、SASを用いた。すべての細胞でVEGF-Aの発現が確認できた。その中でもHSC-3においてVEGF-Aの発現量が最も高かった。そこで、HSC-3をヌードマウスに移植することとした。
ヌードマウス癌背部皮下移植モデルを用いて、抗腫瘍効果を有し、正常組織への副作用が少ないベバシズマブの濃度を決定したうえで、ベバシズマブの局所注入療法を行い、腫瘍体積測定、画像解析による腫瘍壊死面積測定、増殖細胞、微小血管やアポトーシスのマーカーを用いた免疫組織学的検討を行い、組織学的に明らかにする予定であった。HSC-3によりヌードマウス癌背部移植モデルを作製し、組織学的評価を行ったところ、腫瘍細胞の密度が予期したものより低いため、以降、細胞密度を高める目的で詳細な検討を行う必要性が生じた。
平成28年度には腫瘍細胞密度の高いヌードマウス癌背部移植モデルを作製できたため、対照群、血管新生阻害剤局所注入療法群を含めた実験を行った。標本摘出後、パラフィン切片を作製し、CD31による微小血管の免疫染色、TUNNEL法による染色を行い、良好な染色結果を得た。
舌への癌移植モデルについては、予備実験で50％の生着率であったため、100％にすべく再度予備実験を行う予定である。また、舌において実験に適した移植部位の検討も行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度には、腫瘍密度を高めたヌードマウス癌背部皮下移植モデルにおける血管新生阻害剤局所注入療法による腫瘍制御効果の組織学的・免疫組織化学的解析を行う。また、口腔扁平上皮癌ヌードマウス舌移植モデルについては、舌において実験に適した部位を選択したうえで移植成功率を100％に高め、血管新生阻害剤局所注入療法による腫瘍制御効果の組織学的・免疫組織化学的解析を行う。
実験結果の解析手法としては、① 腫瘍体積の測定、② パラフィン切片の作製、③ HE染色による組織学的検討、④ Ki-67免疫染色による腫瘍細胞の増殖率の検討、⑤ TUNNEL法によるアポトーシスの検討、⑥ CD31免疫染色による微小血管密度の測定、⑦ α-SMA免疫染色による検討、⑧ 画像解析装置による腫瘍壊死面積の測定を行い、対照群、実験群における腫瘍の増殖能、アポトーシスについて検討する。これらの結果をもとに血管新生阻害剤局所注入療法の有効性を明らかにする。
得られたデータの統計解析を行い、口腔扁平上皮癌ヌードマウス背部皮下移植モデルに対する血管新生阻害剤局所注入療法の効果に関する論文原稿を作成し、英文校正後、英文誌に投稿する。また、口腔扁平上皮癌ヌードマウス舌移植モデルに対する血管新生阻害剤局所注入療法の効果に関する論文原稿を作成し、英文校正後、誌上発表する。併せ、学会発表も行う予定である。

Causes of Carryover

平成28年度には腫瘍細胞密度の高いヌードマウス癌背部移植モデルを作製できたため、対照群、血管新生阻害剤局所注入療法群を含めた実験を行った。標本摘出後、パラフィン切片を作製し、CD31による微小血管の免疫染色、TUNNEL法による染色を行った。しかしながら、予定していたすべての染色を終えていない。
また、舌への癌移植モデルについては、予備実験で50％の生着率であったため、100％にすべく再度予備実験を行う予定である。また、舌において実験に適した移植部位の検討も行う予定である。

Expenditure Plan for Carryover Budget

平成28年度には腫瘍細胞密度の高いヌードマウス癌背部移植モデルについて、対照群、血管新生阻害剤局所注入療法群を含めた実験を行い、標本摘出後、パラフィン切片を作製した。①CD31による微小血管の免疫染色、②TUNNEL法による染色を行った。しかしながら、予定していたすべての染色を終えていない。残りの検討として、③増殖能を表わすKi-67染色、④腫瘍血管を観察するためのα-SMA染色を行った後、①、②、③、④の陽性率をカウントし、統計学的解析を行う。このため、③、④の試薬購入が必要である。
また、舌への癌移植モデルについては、舌において実験に適した移植部位の検討したうえで、生着率を100％にすべく再度予備実験を行う予定である。このため、動物に加えて、細胞培養試薬、上記①、②、③、④の免疫染色試薬を購入する。さらに、英文校正費用、論文投稿費用、学会発表旅費などが必要となる。