2015 Fiscal Year Research-status Report
凍結切片によるiPS細胞の分化誘導メカニズムの解明とその品質評価法確立への応用
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26463029
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
下間 雅史 鶴見大学, 歯学部, 非常勤講師 (50612008)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
里村 一人 鶴見大学, 歯学部, 教授 (80243715)
舘原 誠晃 鶴見大学, 歯学部, 講師 (90380089)
徳山 麗子 鶴見大学, 歯学部, 助教 (20380090)
井出 信次 鶴見大学, 歯学部, 助教 (00611998)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 分化誘導 / 品質評価 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度までに得られた凍結切片上分化誘導の結果を踏まえ、各種iPS細胞における特定組織・臓器への分化誘導刺激に対する反応性の差の検討を行った。具体的には、特定の組織・臓器への分化誘導刺激に対する各種iPS細胞の反応性の差について、各種体細胞由来別、あるいは樹立方法別による分化誘導効率を統計学的に解析した。また、この結果からiPS細胞の分化誘導刺激に対する反応性の差の評価に本法が応用可能かどうかについても併せて検討した。その結果、各種iPS細胞はその由来、樹立方法の差により、凍結切片上での分化誘導刺激に対する反応性に差があることが明らかとなった。このことから、凍結切片上でのiPS細胞の分化誘導法はiPS細胞の品質評価法にも応用できる化膿性が示唆された。また、凍結切片上培養におけるiPS細胞の分化誘導メカニズムを解明することを目指して、１．液性タンパク質因子（分化・増殖因子）、２．細胞外基質（組織の微細構造を含む）および３．microRNAの３つの観点から検討を行うこととし、サンプリングを進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は当初計画どおり、凍結切片上における分化誘導効率の差から、本研究における凍結切片上培養法による分化誘導法がiPS細胞の品質評価法としても有用である可能性を示すことができた。また、この凍結切片上培養法における分化誘導法のメカニズムの解明に向けて、様々な視点から検討を加えるためのサンプリングを順調に進めている。これらのことから、本研究は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに得られた凍結切片上でのiPS細胞の分化誘導におけるメカニズムを解明することを目的に、以下の３点から検討を行う。
１．液性タンパク質因子を対象とした研究計画：脳、脊髄、肝臓、膵臓、唾液腺などの各種組織・臓器の凍結切片を作製し、前年度と同じ方法でiPS細胞の分化誘導を行う。この際一部の凍結切片を4%パラホルムアルデヒドまたは1%グルタールアルデヒドにて4℃、30分間固定した後、iPS細胞を播種し、分化誘導を行う。一定期間培養した後、用いた各組織・臓器の機能細胞に特異的なマーカー分子の発現を免疫細胞化学的手法を用いて解析し、未固定凍結切片と固定凍結切片の両者における陽性細胞率（すなわち分化誘導効率）を比較検討することにより、本法における分化誘導が液性タンパク質因子によるものか否か明らかにする。
２．細胞外基質（組織微細構造）を対象とした研究計画：前項の場合と同様に各種組織・臓器の固定凍結切片を作製し、低濃度トリプシン、ディスパーゼおよびコンドロイチナーゼABCで1～10分間処理し、凍結切片中に存在する各種細胞外基質組成およびその微細構造を変化させる。このようにして作製した固定凍結切片上にiPS細胞を播種し前項と同様の方法で分化誘導効率およびSEM（走査型電子顕微鏡）による表面構造変化との関係性につき検討を加え、主に細胞外基質の微細構造がiPS細胞の分化に及ぼす影響につき明らかにする。
３．microRNAを対象とした研究計画：幹細胞の自己複製能や分化能をコントロールしているとされるmiRNA（microRNA）に着目し、各種組織・臓器よりmiRNAを抽出、これを培養液中に添加もしくはカバーグラス上に固定化してiPS細胞の培養を行い、分化誘導効率を指標としてmiRNAの関与の有無、重要度につき検討を加える。
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