造影剤リゾビストを用いた温熱療法とセツキシマブ併用による口腔癌治療の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26463053
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 小泉 敏之 横浜市立大学, 附属病院, 講師 (80323575)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 來生 知 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (30545059) ; 藤内 祝 横浜市立大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (50172127) ; 光藤 健司 横浜市立大学, 医学部, 准教授 (70303641)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 口腔癌 / ハイパーサーミア / セツキシマブ / 磁性体ナノ粒子

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、磁性体ナノ粒子（臨床用造影剤：リゾビスト）を用いた顎・口腔への応用を可能とする、新たな温熱療法の開発および温熱刺激でのEGFR発現誘導による、セツキシマブの抗腫瘍効果増強の可能性について検討することで、口腔癌の新たな治療法の確立を目指すものである。本年度は、ヒト由来扁平上皮癌細胞株に対するリゾビストによるハイパーサーミアの抗腫瘍効果について検討するため、各種条件設定を主に行った。すなわち、リゾビストのヒト由来扁平上皮癌細胞株への取り込みについての至適条件の設定および交流磁場下でのリゾビストの発熱条件の確認を行った。細胞はヒト由来扁平上皮癌細胞（OSC-19細胞, HSC-3細胞）を用いた。アポトーシスの評価は、Annexin Vと7-amino-actinomycin D (以下7-AAD)にて染色し、フローサイトメトリーを用いて測定した。細胞周期は、細胞をPropidium Iodide (PI)で染色し、フローサイトメトリーで測定した。温度測定はサーモグラフィーを使用した。交流磁場発生装置 は、 HOT SHOTで 周波数308 kHz 　電流250Aの条件下で行った。交流磁場下で培養細胞に添加したリゾビストは、42℃以上まで温度上昇を示した。交流磁場を用いてリゾビストを発熱させることで得られる温熱作用でアポトーシスは誘導された。細胞周期に関しては、大きな変化は認められなかった。MRI造影剤であるリゾビストは、交流磁場下で発熱し温熱療法として応用が可能であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

おおむね計画通りの進捗である。本年度は、ヒト由来扁平上皮癌細胞株に対するリゾビストによるハイパーサーミアの抗腫瘍効果について検討するため、各種条件設定を主に行った。すなわち、リゾビストのヒト由来扁平上皮癌細胞株への取り込みについての至適条件の設定および交流磁場下でのリゾビストの発熱条件の確認を行った。細胞はヒト由来扁平上皮癌細胞（OSC-19細胞, HSC-3細胞）を用いた。アポトーシスの評価は、Annexin Vと7-amino-actinomycin D (以下7-AAD)にて染色し、フローサイトメトリーを用いて測定した。細胞周期は、細胞をPropidium Iodide (PI)で染色し、フローサイトメトリーで測定した。温度測定はサーモグラフィーを使用した。交流磁場発生装置 は、 HOT SHOTで 周波数308 kHz 　電流250Aの条件下で行った。リゾビストを温熱療法に用いるため、交流磁場下でリゾビストによる温度上昇の条件検討を行った。サーモグラフィーにおいて交流磁場内に静置した培地に溶解したリゾビストは、10分後に42℃に達することを確認した。リゾビストを温熱療法(42.5℃)で使用するため、リゾビストの濃度と交流磁場装置の電流の大きさ変化させて温度上昇の変化をサーモメーターで確認した。交流磁場装置を電流230 A 周波数308 kHz の条件でリゾビストを1mM、10mM、20mMの濃度での温度を確認した。リゾビストは、濃度依存的に温度の上昇を示した。交流磁場下でリゾビストは10mMで42℃まで温度上昇することが確認された。上記検討から得られた条件をに用いて、リゾビストの発熱による温熱作用でアポトーシスは誘導された。細胞周期に関しては、大きな変化は認められなかった。MRI造影剤であるリゾビストは、交流磁場下で発熱し温熱療法として応用が可能であった。

Strategy for Future Research Activity

われわれは、ヒト由来扁平上皮癌細胞に対して加温刺激で抗腫瘍効果が発揮されることを確認している。また、交流磁場下でリゾビストが温度上昇すること、加温刺激でヒト由来扁平上皮癌細胞においてEGFRが高発現することをこれまでに示してきた。平成26年度には、ヒト由来扁平上皮癌細胞に対して、交流磁場下でのリゾビストによる抗腫瘍効果と温熱加温による抗腫瘍効果を示した。温熱加温によるEGFRの発現に関しては、HSPファミリーの免疫活性が関与していることが示唆されている。そこで、EGFRの発現を解明することでより効率的にEGFRを誘導する。EGFRを高発現させたヒト由来扁平上皮癌細胞に、EGFRを標的としている抗癌剤セツキシマブを併用することで抗腫瘍効果のさらなる効果が発揮されると示唆される。平成27年度は、ヒト由来扁平上皮癌細胞を用いたハイパーサーミアに伴うEGFR発現誘導の検討を行う予定である。インキュベーターにより温熱加温を行った細胞でEGFRの発現が上昇することはWestern blotting法で確認が出来ている。しかし、リゾビスト温熱加温においてその後の温熱活性が誘導されるかは明らかになっていない。今後の温熱加温によって起因される免疫活性を検討しEGFR発現誘導における作用機序の足掛かりとする。具体的には、ヒト由来扁平上皮癌細胞株を調整し、培養用インキュベーターで42.5℃に加温刺激を行う。刺激後、温熱加温によって誘導される可能性のあるHSPファミリー、EGFR、EGFRのリン酸化、MAPK，MAPKのリン酸化の発現をWestern blotting評価をする予定である。

Causes of Carryover

今年度は各種条件設定を主に行った。すなわち、リゾビストのヒト由来扁平上皮癌細胞株への取り込みについての至適条件の設定および交流磁場下でのリゾビストの発熱条件の確認を行った。温度測定はサーモグラフィーを使用した。交流磁場発生装置 は、 HOT SHOTを用いて、周波数と電流の調整が可能である。リゾビストを温熱療法に用いるため、交流磁場下でリゾビストによる温度上昇の条件検討を行った。リゾビストは、周波数、電流、また濃度依存的に温度の上昇を示した。交流磁場下でリゾビストは10mMで42℃まで温度上昇することが確認された。これらは事前に確認していたことを一部応用可能であり、また理論的に期待した結果を得ることができたものも多っかたため、支出を一部押さえることが可能であった。

Expenditure Plan for Carryover Budget

至適条件の設定については次年度においても引き続き検討が必要な項目であり、また一部においては設定を詰め切れていないものもある。そのため、次年度使用額が生じているものの、これは次年度以降の研究遂行にとって必要なものである。
具体的には、交流磁場の作用だけで、ヒステリシス損失と渦電流損失による発熱する可能性がある。今後の実験において、動物実験でリゾビストが集積された腫瘍局所のみ温熱効果を発揮させることが大事であり、細胞実験で確認することが必要である。ヒト由来扁平上皮癌細胞に対して交流磁場下でのリゾビストで加温し抗腫瘍効果が発揮されることを確認する。上記検討の後、ヒト由来扁平上皮癌細胞を用いたハイパーサーミアに伴うEGFR発現誘導の検討を行う予定である。