細菌添加培養処理による感染性ウイルス選択的遺伝子定量法の開発

2015 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26550081
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 片山 浩之 東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (00302779)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: PCR / 誤陽性 / 消毒 / ウイルス / 細菌

Outline of Annual Research Achievements

PCR法ではウイルスの感染性の有無について判定できないとされてきている。環境水中に含まれるウイルスには、さまざまな要因によりダメージを受けたウイルス粒子が存在し、感染性のあるウイルス数を定量するのが困難な状況となっている。本研究では、PCR法の前処理として、感染性のあるウイルスを選択的に残す手法の開発を行う。この手法は、細菌添加培養処理による感染性ウイルス選択的遺伝子定量法であり、ウイルスの感染リスクに関して実際のリスクを反映した評価手法として、レクリエーション水利用や上水道などの分野において、検査法として受け入れられる可能性がある。
様々な菌株を用い、RNAの分解を試みたが、短時間で99%以上のRNA分解（RT-PCRによる定量ベース）を達成することが困難であることが分かった。そこで、細菌処理に代わり、がん治療等で遺伝子に働く治療薬としても用いられているプラチナに着目し、研究を行った。
浄水後の水におけるウイルス測定においては、不活化したウイルスの測定について偽陽性の課題がある。近年、EMAやPMAなどの前処理と組み合わせてPCRを行うことで、損傷したウイルスと完全なウイルスの識別をする方法が使用されているが、培養法との結果を表せていない。本研究では、プラチナ化合物を利用し、完全なウイルスの選択的な検出を試みた。
ポリオウイルスを用い、遊離塩素1㎎/Lで4分接触し、3Log（99.9%）程度の不活化を行った。定量PCRにおいては不活化は0.3Log以下に過小評価され、EMA-PCRにおいても0.5Log程度の不活化と過小評価されたが、cis-DDPを用いた方法では2.3Logの不活化が観察され、より培養法に近い結果を得ることができた。このことから、cis-DDPを用いた方法はウイルスの不活化を評価するために効果的な方法であることが分かった。