生体内の亜酸化窒素の産生制御と消去

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26620140
• Research Institution: The Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 城 宜嗣 独立行政法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 主任研究員 (70183051)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 一酸化窒素 / 脱窒菌 / 嫌気呼吸 / 細胞内タンパク質複合体

Outline of Annual Research Achievements

一酸化窒素還元酵素NORをノックアウトした緑膿菌は、脱窒条件下（硝酸イオン存在、嫌気条件）では生育しなかった。そこに、NORをコードしたプラスミドを導入すると、緑膿菌は生育できるようになった。すなわち、緑膿菌をホストとする、NORの発現系構築に成功した。NO産生酵素である亜硝酸還元酵素とNORとの複合体の生理的意義を確認するために、両酵素の相互作用部位にあたるアミノ酸残基を変異させたNORをこの発現系に導入した。このNOR変異緑膿菌は、野生型の緑膿菌と比較して生育が遅くなった。変異により両酵素の相互作用が弱くなった結果と解釈した。このことより、NiR-NOR複合体はNOを細胞内に拡散させないシステムである事を確認した。
さらにNORとNiRと、それらへの電子供与体タンパク質である、アズリンあるいはチトクロムc551との相互作用を、スペクトルの経時変化により解析する事を開始さいた。さらに、NOR/NiR/電子供与体の三者複合体の結晶化を開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

緑膿菌をホストとするNOR発現系の構築成功は大変大きな成果である。これにより、今まで大腸菌をホストとしては成功していなかった変異体の調製が可能となった。この発現系を用いれば、NiR-NOR複合体の生理的な意義の解明も可能となる。

Strategy for Future Research Activity

基本的には今年度の方向で研究を進め、その進展を加速する。
緑膿菌をホストとするNOR発現系を用いて、複合体形成に関わるアミノ酸残基を変異させたNOR変異体を調製し、NiR-NOR複合体の生理的意義の解明につなげていきたい。蛍光ラベルしたNORならびに蛍光ラベルしたNiRを同時に緑膿菌内に発現するシステムの構築をめざす。それを用いた細胞内での両酵素の動態を蛍光顕微鏡で観察すると同時に、複合体形成を阻害する薬剤検索にも取りくむ。

Research Products

• [Journal Article] Crystal Structure, Exogenous Ligand Binding and Redox Properties of an Engineered Diiron Active Site in a Bacterial Hemerythrin (2014)
  • Author(s): A. Onoda, Y. Okamoto, H. Sugimoto, Y. Takano, S. Hirota, D. Kurtz, Y. Shiro, T. Hayashi
  • Journal Title: Chem. Comm. Volume: 50 Pages: 3421-3423
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structures of Reduced and Ligand-Bound Nitric Oxide Reductase Provide Insights into Functional Differences in Respiratory Enzymes (2014)
  • Author(s): N. Sato, S. Ishii, H. Sugimoto, T. Hino, Y. Fukumori, Y. Sako, Y. Shiro, T. Tosha
  • Journal Title: PROTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics Volume: 82 Pages: 1258-1271
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] An in vivo Inhibitory Effect on the Heme Uptake of Pseudomonas aeruginosa by Its Hemophore (HasAp) Carrying Synthetic Metal Complexes (2014)
  • Author(s): C. Shirataki, O. Shoji, M. Terada, S. Ozaki, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Watanabe
  • Journal Title: Angw. Chem. Int. Ed. Volume: 53 Pages: 2862-2866
  • DOI: 10.1002/anie.200
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Characterization of Quinol-Dependent Nitric Oxide Reductase from Geobacillus Stearothermophilus: Enzymatic Activity and Active Site Structure (2014)
  • Author(s): E. Terasaka, N. Okada, N. Sato, Y. Sako, Y. Shiro, T. Tosha
  • Journal Title: Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics Volume: 1837 Pages: 1019-1026
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Disulfide Bonds Regulate Binding of Exogenous Ligand to Human Cytoglobin (2014)
  • Author(s): H. Tsujino, T. Yamashita, A. Nose, K. Kukino, H. Sawai, Y. Shiro, T. Uno
  • Journal Title: J. Inor. Biochem. Volume: 135 Pages: 20-27
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Palladium-Nanoparticle-Catalyzed 1,7-Palladium Migration Involving C-H Activation, Followed by Intramolecular Amination: Regioselective Synthesis of N1-Arylbenzotriazoles and an Evaluation of Their Inhibitory Activity Towards Indoleamine 2,3-Dioxygenase (2014)
  • Author(s): K. Takagi, M. Al-Amin, N. Hoshiya, J. Wouters, H. Sugimoto, Y. Shiro, H. Fukuda, S. Shuto, M. Arisawa
  • Journal Title: J. Org. Chem. Volume: 79 Pages: 6366-6371
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Structure-function Analyses of Cytochrome P450revI Involved in Reveromycin A Biosynthesis and Evaluation of the Biological Activity of Its Aubstrate, Reveromycin T (2014)
  • Author(s): S. Takahashi, S. Nagano, T. Nogawa, N. Kanoh, M. Uramoto, M. Kawatani, T. Shimizu, T. Miyazawa, Y. Shiro, H. Osada
  • Journal Title: J. Biol. Chem. Volume: 289 Pages: 32446-32458
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Activation of Wild-type Cytochrome P450BM3 by the Next Generation of Decoy Molecules: Enhanced Hydroxylation of Gaseous Alkanes and Crystallographic Evidence (2014)
  • Author(s): Z. Cong, O. Shoji, C. Kasai, N. Kawakami, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Watanabe
  • Journal Title: ACS Catalysis Volume: 5 Pages: 150-156
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Generation, Channeling and Decomposition of NO in Bacterial System (2015)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: “Metals in Biology” Gordon Research Conference
  • Place of Presentation: Ventura, USA
  • Year and Date: 2015-01-25 – 2015-01-30
  • Invited
• [Presentation] これからの生物無機化学 ー金属タンパク質の過去と未来ー (2014)
  • Author(s): 城 宜嗣
  • Organizer: 第87回日本生化学会
  • Place of Presentation: 京都
  • Year and Date: 2014-10-15 – 2014-10-18
  • Invited
• [Presentation] Generation, Propagation and Decomposition of Nitric Oxide in Bacterial Denitrification (2014)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: 18th European Bioenergetics Conference (EBEC 2014)
  • Place of Presentation: Lisbon, Portugal
  • Year and Date: 2014-07-12 – 2014-07-17
  • Invited
• [Presentation] Bacterial Nitrite Reductase and Nitric Oxide Reductase; NO Generation, Channeling and Decomposition (2014)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: Eighth International Conference on Porphyrins and Phtalocyanines (ICPP8)
  • Place of Presentation: Istanbul, Turky
  • Year and Date: 2014-06-22 – 2014-06-27
  • Invited
• [Book] 鉄の事典 (2014)
  • Author(s): 藤井 浩、城 宜嗣
  • Total Pages: 820
  • Publisher: 朝倉書店
• [Remarks] 理化学研究所 城生体金属科学研究室
  • URL: http://www.riken.jp/biometal/index.htm
• [Remarks] 兵庫県立大学 理学部 細胞制御Ⅱ研究室
  • URL: http://www.sci.u-hyogo.ac.jp/life/regulation/index-j.html