Regulation of nitrous oxide formation in cell

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26620140
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 城 宜嗣 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 主任研究員 (70183051)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 一酸化窒素 / 脱窒菌 / 嫌気呼吸 / 亜酸化窒素 / 細胞内タンパク質複合体

Outline of Annual Research Achievements

一酸化窒素の産生酵素（亜硝酸還元酵素：NiR）と消去酵素（一酸化窒素還元酵素：NOR）の複合体に関しては、得られた結晶構造を基盤に、分子動力学計算をした。その結果、この複合体は安定である事が明らかとなった。さらに、結晶構造で発見された両酵素間の静電的相互作用（Glu119(NOR)---ARg71(NiR)）に加えて、Lys100(NOR)がNiRのヘムcのプロピオン酸側鎖と時間依存的な相互作用をする事が分かった。NORのこの２つの残基に注目し、昨年度構築したNOR発現系を用いて、Lys100Glu、Glu119ArgのNOR変異体の遺伝子を含む緑膿菌の培養曲線を調べた結果、これらの成長は著しく悪かった。こお２つの変異体を精製して活性をしらべたが、NO消去は高活性であり、この２つの残基はNiRとの相互作用に重要得あると結論した。さらに、理論計算からは、NiRと細胞膜との相互作用も複合体形成に必須であることも明らかとなった。一方、この複合体のNiRで産生されたNOは、その疎水性により速やかに細胞膜内に移動し、すぐ近くに存在するNORに取込まれ消去される事も示す事ができた。以上の事から、細胞膜近傍でのNiR-NOR複合体形成は、緑膿菌の嫌気条件下での成長に必須であると結論した。
NO産生およびNO消去反応において、NiR-NOR複合体に電子を供与するチトクロムc551との三者複合体の構造解析をめざして、クライオ電子顕微鏡用試料の作成を開始した。
亜酸化窒素（N2O）産生を阻害する目的で、理研のケミカルバンクを利用してNiRならびにNORの阻害剤を検索した。今までのところ、NiRの活性を阻害する化合物が３種見つかった。構造解析のために、これら化合物とNirとの複合体の結晶化も開始した。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of Liverpool(英国)
  • Country Name: UNITED KINGDOM
  • Counterpart Institution: University of Liverpool
• [Int'l Joint Research] Stockholm University(スウェーデン)
  • Country Name: SWEDEN
  • Counterpart Institution: Stockholm University
• [Journal Article] Dynamics of Nitric Oxide Controlled by Protein Complex in Bacterial System (2017)
  • Author(s): E. Terasakaa, K. Yamada, P.-H. Wang, K. Hosokawa, R. Yamagiwa, K. Matsumoto, S. Ishii, T. Mori, K. Yagi, H. Sawai, H. Arai, H. Sugimotoa, Y. Sugitac, Y. Shiroa, T. Tosha
  • Journal Title: Proc. Natl. Acd. SCI. USA Volume: 印刷中 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
• [Journal Article] Crystal Structure of Bacterial Heme Importer Complex in Inward-facing Conformation (2016)
  • Author(s): Naoe, Y., Nakamura, N., Doi, A., Nakamura, H., Shiro, Y., Sugimoto, H.
  • Journal Title: Nature Commun. Volume: 7 Pages: -
  • DOI: 10.1038/ncomms13411
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Study of the Dynamics of the Heme Pocket and C-helix in CooA upon CO Dissociation Using Time-resolved Visible and UV Resonance Raman Spectroscopy. (2016)
  • Author(s): Otomo, A., Ishikawa, H., Mizuno, M., Kimura, T., Kubo, M., Shiro, Y., Aono, S., Mizutani, Y.
  • Journal Title: J. Phys. Chem. B Volume: 120 Pages: 7836-7843
  • DOI: 10.1021/acs.jpcb.6b05634
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Regulatory Implications of Structural Changes in Tyr201 of the Oxygen Sensor Protein FixL (2016)
  • Author(s): T. Yamawaki, H. Ishikawa, M. Mizuno, H. Nakamura, Y. Shiro, Y. Mizutani
  • Journal Title: Biochemistry Volume: 55 Pages: 4027-4035
  • DOI: 10.1021/acs.biochem.6b00405
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A Substrate-Binding-Sate Mimic H2O2-Dependent Cytochrome P450 Produced by One-point Mutagenesis and Peroxygenation of Non-native Substrate (2016)
  • Author(s): O. Shoji, T. Fujishiro, K. Nishio, Y. Kano, H. Kimoto, S.-C. Chien, H. Onoda, A. Muramatsu, S. Tanaka, A. Hori, H. Sugimoto, Y. Shiro, Y. Watanabe
  • Journal Title: Catalysis Science & Technology Volume: 6 Pages: 5806-5811
  • DOI: 10.1039/C6CY00630B
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Structural Basis for Molecular Mechanism of Bacterial Nitric Oxide Reductases (2017)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: IGER Intl. Symp. Physics of Life
  • Place of Presentation: 名大、ES Hall、名古屋
  • Year and Date: 2017-03-25 – 2017-03-26
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] NO Dynamics in Biology: Its Generation and Decomposition (2016)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: Royal Society Meeting Inorganic Chemistry
  • Place of Presentation: 阪大、銀杏会館、豊中
  • Year and Date: 2016-10-26
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Damage-free X-ray Crystallographic Analysis of P450nor in the NO Bound Form using SACLA. (2016)
  • Author(s): Kubo, M., Nomura, T., Nishida, T., Tosha, T., Sugimoto, H., Kimura, T., Takano, Y., Yamashita, K., Hirata, K., Ueno, G., Ago, H., Yamamoto, M., Shiro, Y.
  • Organizer: British Biophysical Society 2016 Biennial Meeting
  • Place of Presentation: Liverpool, UK
  • Year and Date: 2016-07-07
  • Invited
• [Presentation] Molecular Mechanism of NO Reduction by Bacterial Nitric Oxide Reductases (2016)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: ICCP9
  • Place of Presentation: Nanjing, China
  • Year and Date: 2016-06-03 – 2016-06-08
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Molecular Mechanism of NO Reduction by Bacterial Nitric Oxide Reductases (2016)
  • Author(s): Shiro, Y.
  • Organizer: 229th ECS Meeting
  • Place of Presentation: San Diego, USA
  • Year and Date: 2016-05-29 – 2016-06-03
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Book] Metalloenzymes in Denitrification (2017)
  • Author(s): T. Tosha, Y. Shiro
  • Total Pages: 452
  • Publisher: Royal Society of Chemistry Metallobiology Series