Development of a premature aging syndrome non-human primate model

2016 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 26640053
• Research Institution: Shiga University of Medical Science
• Principal Investigator: 伊藤 靖 滋賀医科大学, 医学部, 准教授 (90324566)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 土屋 英明 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 技術専門職員 (10378440) ; 佐々木 えりか 公益財団法人実験動物中央研究所, 応用発生学研究センター, センター長 (70390739) ; 依馬 正次 滋賀医科大学, 動物生命科学研究センター, 教授 (60359578) ; 小笠原 一誠 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (20169163)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 老化 / 癌 / トランスレーショナルリサーチ / 病理学 / 霊長類モデル / ゲノム編集 / レンチウイルスベクター

Outline of Annual Research Achievements

前年度にゲノム編集が可能であることを確認したWerner RecQ DNAヘリカーゼの標的配列を含むプラスミドベクターからCRISPR/Cas9システム用ガイドRNAを作成した。また、Cas9を発現させるmRNAを作製した。
カニクイザルメスにホルモンを投与し、排卵を誘発した。腹腔鏡を用いて卵胞から卵細胞を回収した。電気刺激法によりオスから精液を採取した。顕微鏡下に精子を卵細胞に注入し、授精を行なった。培養を継続し、受精卵の生存を確認後、Werner RecQ DNAヘリカーゼのゲノム編集用ガイドRNAとCas９のmRNAを顕微鏡下に受精卵に注入した。さらに培養を継続し、卵割、発生が確認された胚を回収し、全ゲノム増幅によりDNA量を増量した。このゲノムを元にPCRにより標的配列を含むDNAを増幅した。塩基配列を確認したところ、半数以上の胚で標的配列に変異が導入されていることが判明した。
胚における変異導入率を確認した上で、上記と同様の顕微受精、遺伝子導入を行い、培養し、桑実胚に発育した胚を仮親に移植した。仮親は月経周期を腹腔鏡で確認し、選抜した。胚移植から１か月後に超音波診断装置により妊娠の成立を確認した。一部の仮親では妊娠が確認できなかった。また、胚を排出、流産した仮親もいた。胚移植から、約160日後に自然分娩にて出産した。現在、出生仔は仮親が成育中である。排出された胚及び流産した胎児のゲノムの塩基配列を決定したところ、標的配列に変異の導入が確認された。

Research Products

• [Journal Article] Potential Risk of Repeated Nasal Vaccination that Induces Allergic Reaction with Mucosal IgE and Airway Eosinophilic Infiltration in Cynomolgus Macaques infected with H5N1 Highly Pathogenic Avian Influenza Virus (2017)
  • Author(s): Nakayama M, Itoh Y, Shichinohe S, Nakabayashi R, Ishigaki H, Sakoda Y, Le QM, Kawaoka Y, Kida H, Ogasawara K
  • Journal Title: Vaccine Volume: 35 Pages: 1008-1017
  • DOI: 10.1016/j.vaccine.2017.01.00
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Vaccination against H9N2 avian influenza virus reduces bronchus-associated lymphoid tissue formation in cynomolgus macaques after intranasal virus challenge infection (2016)
  • Author(s): Nakayama M, Ozaki H, Itoh Y, Soda K, Ishigaki H, Okamatsu M, Sakoda Y, Park C-H, Tsuchiya H, Kida H, Ogasawara K
  • Journal Title: Pathology International Volume: 66 Pages: 678-686
  • DOI: 10.1111/pin.12472
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Surgical technique for allogeneic uterus transplantation in macaques (2016)
  • Author(s): Obara H, Kisu I, Kato Y, Yamada Y, Matsubara K, Emoto K, Adachi M, Matoba Y, Umene K, Nogami Y, Banno K, Tsuchiya H, Itagaki I, Kawamoto I, Nakagawa T, Ishigak Hi, Itoh Y, Ogasawara K, Saiki Y, Sato S-i, Nakagawa N, Shiina T, Aoki D, Kitagawa Y
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 6 Pages: 35989
  • DOI: 10.1038/srep35989
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Sensitization with vaccinia virus encoding H5N1 hemagglutinin restores immune potential against H5N1 influenza virus (2016)
  • Author(s): Yasui F, Itoh Y, Ikejiri A, Kitabatake M, Sakaguchi N, Munekata K, Shichinohe S, Hayashi Y, Ishigaki H, Nakayama M, Sakoda Y, Kida H, Ogasawara K, Kohara M
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 6 Pages: 37915
  • DOI: 10.1038/srep37915
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Remarks] 本研究室より発表した論文の紹介
  • URL: http://www.shiga-med.ac.jp/~hqpatho2/publications.html
• [Remarks] 重点研究プロジェクト
  • URL: https://www.shiga-med.ac.jp/research-and-collaboration/priority-projects-and-research-results