2015 Fiscal Year Research-status Report
グレリン受容体を活性化するモノクローナル抗体の作製と受容体結晶構造解析への応用
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26650025
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| Research Institution | Kurume University |
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Principal Investigator |
児島 将康 久留米大学, 分子生命科学研究所, 教授 (20202062)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | グレリン / グレリン受容体 / モノクローナル抗体 / ナノボディ / アルパカ / 結晶構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では申請者らが発見した摂食亢進ホルモンのグレリンを対象として、その受容体を活性化するモノクローナル抗体を作製し、活性型グレリン受容体の結晶構造解析のツールとして使うことを計画した。昨年までの研究で、無細胞合成系で発現させたグレリン受容体を抗原として通常の方法でマウス・モノクローナル抗体を作成したが、グレリン受容体の立体構造を認識する抗体は得られなかった。そこでグレリン受容体に対するアルパカのナノボディを作成することに計画を変更した。
アルパカやラクダなどにある一本鎖重鎖抗体の可変部位はナノボディと呼ばれており、通常の抗体よりも分子量が小さく、かつ抗原認識力は通常の抗体と変わらない。分子量は約15,000とコンパクトなため（マウス・モノクローナル抗体の分子量は約150,000と10倍大きい）、グレリン受容体のリガンド結合部位を認識できると考えた。また一本鎖で抗原を認識できるため、ナノボディは大腸菌などで組換えタンパク質として合成もしやすく、本研究の目的である受容体活性化のために使いやすい。
方法としては、まずアルパカへの免疫抗原として、グレリン受容体を無細胞系でタンパク合成し、リポソームに組み込んだ。このグレリン受容体抗原のアルパカへの免疫は、国内で唯一実験用のアルパカを飼育しているアークリソース社で行った。合計5回の免疫ののち、抗体価をチェックすると、一本鎖重鎖抗体の増加が認められ、グレリン受容体に対する抗体価も上昇していた。このアルパカからリンパ球を採取し、mRNAを単離、cDNAに変換したのち、混合プラマーをデザインして、一本鎖重鎖抗体の可変部位を挟むナノボディ部位を増幅した。増幅したcDNAはナノボディ由来であることをシークエンスの解析によって確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（理由）モノクローナル抗体の作製から、グレリン受容体に対するナノボディ作製へと手法を変更し、それが順調に進展しているため。
モノクローナル抗体作製とナノボディ作製の流れは共通している部分が多く、うまくいかなかったマウス・モノクローナル抗体での経験が生かされていると思う。
抗原の調節は無細胞合成系で行い、合成したグレリン受容体をリポソームに組み込んだ。この方法はモノクローナル抗体のときと同じである。このプロテオ・リポソームを抗原としてアルパカに免疫し、血清チェックでグレリン受容体に対する抗体価の上昇を確認できた。その後、リンパ球のmRNAからcDNAの合成と進み、ナノボディ領域のcDNAを増幅した。現在、この増幅したcDNAを組み込んだファージティスプレイ・ライブラリを作製中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ファージディスプレイ・ライブラリでは一度に数万クローンのナノボディをスクリーニングできる。約千クローンのチェックが限度のモノクローナル抗体に比べて、この点が極めて効率の良いシステムである。
まずグレリン受容体を免疫して得られたアルパカのリンパ球からのファージディスプレイ・ライブラリを作製することを継続する。この過程では鹿児島大学伊東教授に指導を受ける。十分な組換え体を含んだファージディスプレイ・ライブラリが作製できれば、グレリン受容体のプロテオ・リポソームを96ウェルプレートに固定し、組換えファージとインキュベートし、抗原に結合するファージを単離する。そのファージからナノボディ部分を増幅し、ナノボディの大腸菌でのタンパク発現を行う。様々な変異や欠失を行ったグレリン受容体タンパクを使って、ナノボディの認識部位を決定する。そののち、グレリン受容体発現細胞に対する活性化をチェックし、目的のグレリン受容体を活性化するナノボディを単離する。
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| Causes of Carryover |
抗原としてのグレリン受容体タンパク質の合成、アルパカへの5回の免疫、抗体価のチェック、リンパ球の単離などの作業に時間がかかったため、一部の研究費を次年度へ移す必要が生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
現在、グレリン受容体を抗原として免疫したアルパカから、ナノボディのファージディスプレイ・ライブラリを作製するところまで進んでいる。次年度使用の分は、ファージディスプレイの作製費用に用いる。
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[Journal Article] Gherlin2015
Author(s)
Müller TD et al. and Kojima M,Kangawa K, Smith RG, Horvath T, Tschöp MH
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Journal Title
Mol Meta
Volume: 4(6)
Pages: 437-460
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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