2014 Fiscal Year Research-status Report
CRISPRiシステムを用いたシス制御領域の新規機能解析法の確立
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26650087
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
安岡 有理 沖縄科学技術大学院大学, Marine Genomics Unit, 研究員 (70724954)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | CRISPR-Cas9 / 遺伝子発現制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CRISPRiシステムを発生学実験に応用し、シス制御領域の機能解析を試みるため、実験に用いる各種dCas9コンストラクトを作成した。そこからmRNAを合成し、Xenopus胚に顕微注入して、各コンストラクトの細胞内局在を、共焦点顕微鏡により観察した。その結果、NLSを融合したコンストラクトは効率よく核に局在していること、GR融合型コンストラクトはDEXの付加によって核へと移行していくことが確認された。また、Western blotting解析により、dCas9コンストラクトは全長タンパク質が合成されていることも示された。NLS融合型、GR融合型、どちらもVP16もしくはenRを付加したものを同時に作成しており、それぞれ人工転写活性化因子、人工転写抑制因子として働くことが期待される。標的配列に対するgRNAコンストラクトとしては、まずLuciferase reporterの転写抑制用gRNAを作成した。さらに、シス制御領域の標的配列として、GAL4UAS、TOPFLASH、Xenopus tropicalis gscのU1領域、Xenopus tropicalis wnt8aのU1領域、に対するgRNAコンストラクトを作成した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定通り、実験に用いる各種コンストラクトを作成し、dCas9の核局在は確認できたが、実際にCRISPRiを試すまでには至らなかった。また、ツメガエル胚以外での解析も進んでいないため、「やや遅れている」という達成度になった。しかし、外来レポーターを用いた実験はすぐにでも始められる状況であり、内在のシス制御領域に対する解析に移るのにそれほどの遅れはないと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、完成したコンストラクトを用いて、外来レポーターに対してCRISPRiが有効かどうかを早急に確認する。実験を効率よく進めるため、研究協力者（東京大学・平良眞規准教授）にコンストラクトを送付し、これら予備実験への協力を依頼する。その後、内在の遺伝子発現制御に対して、CRISPRiが作用しうるかどうかを検討する。ツメガエル胚以外での解析は、ホヤ胚にしぼり、brachyuryの発現制御機構に対するCRISPRiの効果を検討する。ヒストン修飾酵素を融合したdCas9は未作成なので、これも作成し、局所的なエピジェネティック操作が可能かどうかだけでも検討する。
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[Journal Article] Occupancy of tissue-specific cis-regulatory modules by Otx2 and TLE/Groucho for embryonic head specification2014
Author(s)
Yasuoka, Y., Suzuki, Y., Takahashi, S., Someya, H., Sudou, N., Haramoto, Y., Cho, K.W., Asashima, M., Sugano, S. and Taira, M.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 5
Pages: Article No.4322
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Evidence for participation of GCS1 in fertilization of the starlet sea anemone Nematostella vectensis: Implication of a common mechanism of sperm-egg fusion in plants and animals.2014
Author(s)
Ebchuqin, E., Yokota, N., Yamada, L., Yasuoka, Y., Akasaka, M., Arakawa, M., Deguchi, R., Mori, T. and Sawada, H.
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Journal Title
Biochem Biophys Res Commun
Volume: 451
Pages: 522-528
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Transcriptional basis of the head organizer in the amphibian gastrula: ChIP seq analysis of the head organizer transcription facotors, Otx2, Lim1 and Gsc2014
Author(s)
Yasuoka, Y., Suzuki, Y., Takahashi, S., Someya, H., Sudou, N., Haramoto, Y., Asashima, M., Sugano, S. and Taira, M.
Organizer
第85回日本動物学会年会
Place of Presentation
東北大学川内北キャンパス（宮城県仙台市）
Year and Date
2014-09-12
Invited
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