2014 Fiscal Year Research-status Report
細胞にアクチンは必要かークラミドモナスを用いた検証ー
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26650136
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| Research Institution | Chuo University |
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Principal Investigator |
箕浦 高子 中央大学, 理工学部, 准教授 (80300721)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | アクチン / amiRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では真核生物の緑藻クラミドモナスにおいて２種類しか存在しないアクチンが、生命活動に必須であるかどうかを検証する手段として、２種類のうちのひとつ、NAP遺伝子のamiRNAによる発現抑制株の作成を試みた。良好な発現抑制株が得られれば、その株においてNAPが発現抑制された時の表現型からNAPの果たす役割を明らかにし、さらにもうひとつのアクチン遺伝子の欠損株ida5との二重変異株の形質から、アクチンを全て欠損したときの生存の可否、可であればその影響を調べることを計画した。
今年度は、２種類のamiRNA発現ベクターを用いてNAP遺伝子発現抑制株を作成した。１つ目は、恒常発現性のami RNA発現ベクターであるpChlamiRNA3intを用いた。まず、WMD3アプリケーションを用いてNAP遺伝子配列においてamiRNAによる発現抑制効果が高いターゲット領域を予測した。そして、pChlamiRNA3intのamiRNA発現カセット内に、予測したNAP遺伝子のターゲット配列を挿入したコンストラクト（NAP- pChlamiRNA3int）を作成した。これをエレクトロポレーションによって野生株に導入し、３株の遺伝子導入株を得た。さらに、これらの株とida5株との掛け合わせを行い、二重変異株の可能性が高い株を複数得た。
nit1プロモーターを持ち、培地中の窒素源によって発現のスイッチングが可能なamiRNA発現ベクターpMS539についても、同様にNAPのターゲット配列を挿入したコンストラクトNAP- pMS539を作成した。これについては、プラスミドサイズが大きく全長での遺伝子導入が困難であったため、NAP のamiRNA発現カセットのみを含む断片の導入を試みた。その結果、野生株への導入株５株が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画通り、本年度は２種類の発現ベクターを用いてNAPのamiRNA発現抑制用コンストラクトを作成した。また、これらのコンストラクトの野生株への導入株をそれぞれ複数得ることに成功した。これらの株は、ゲノム内にNAP-amiRNA発現カセットが挿入されたことをPCRにより確認済みである。また、NAP-pChlamiRNA3intについては、さらにida5株との掛け合わせを行い、二重変異株の作成を試みた。接合後に生じる四分子のうち、それぞれ二分子が各親株から形質を受け継ぐ。このため、野生株と、運動性が野生株の半分程度であるida5株との掛け合わせにおいては高運動性株２株（野生株由来）と、低運動性２株（ida5株由来）が得られる。NAP-pChlamiRNA3intとida5株を掛け合わせではいくつかの四分子の組み合わせが得られたが、四分子全てがコロニー形成したものはなく、最大で三分子であった。また、各組み合わせの中で比較的運動性株の良い２株はida5株の形質を受け継いでいないと考えると、残る株のうちゲノム中にNAP-pChlamiRNA3int発現カセットが挿入されていた株は、NAP-pChlamiRNA3intとida5との二重変異株である可能性が濃厚である。興味深いことにそれらの株は全く運動性を示さなかった。これらの株について、現在詳細な運動解析を進めているが、２つのうち１つのアクチン遺伝子を欠損し、かつ２つ目のNAP遺伝子の発現が抑制されると生育困難になるか、生育可能であっても鞭毛形成などの運動機能が阻害される可能性が示唆された。予備的な観察結果ではあるが、今後これらの株の２つのアクチン遺伝子欠損の程度と形質を詳しく調べ、細胞内での２種のアクチンの必須性について評価する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、得られたNAP-pChlamiRNA3int導入株およびida5との二重変異株について、それぞれのNAP遺伝子の発現抑制の程度を評価したうえで、その形質を詳細に調べる。とくに運動性、細胞増殖能、接合管形成能に着目して調べる。運動性については、アクチンが鞭毛内腕ダイニンの構成成分であるため、２つのアクチンが失われると運動性が低下する可能性が高いことと、申請者らのこれまでの研究により、両アクチン遺伝子が鞭毛形成時に高発現することがわかっており、鞭毛形成時の何らかの機能が示唆されるためである。接合管はアクチン重合により伸長する構造である。NAPの発現が抑制された状況で、１種類のアクチンのみで伸長するか否かを調べる。これにより２つのアクチンの重合性の違いを明確にする。
nit1プロモーターを持つNAPの発現抑制株についても、スイッチをオンにした時の各株の発現抑制の程度を評価したうえで上記の形質について解析する。また、恒常発現株と同様にida5株との二重変異株を作成する。アクチンが２つとも失われると細胞が生育できない場合、鞭毛や接合管の形成能の評価をするためにはその時点までNAP発現抑制のスイッチをオフにしておく必要がある。
さらに、相同組換え（HR）によるNAP遺伝子破壊を想定し、HRの生じやすい株の取得を試みている。UV照射により突然変異を誘導したダイニン外腕欠損株に薬剤耐性遺伝子を含む破壊型アクチン遺伝子を導入した。この遺伝子がHRによって既存のアクチン遺伝子の遺伝子座に挿入されると、ダイニン外腕とほとんどの内腕が欠損するため、運動性が消失することが見込まれる。これを指標にスクリーニングを行ったところ、アクチン遺伝子座においてHRが生じた細胞集団が得られた。今年度はこれらの細胞集団の株化を進め、任意の遺伝子についてHRによる導入が可能であるか否かを検証する。
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| Causes of Carryover |
物品購入の際に端数が生じたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度物品購入費に加えて使用する。
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