2014 Fiscal Year Research-status Report
植物の環境ストレス応答におけるイノシトールピロリン酸の役割
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26660003
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
吉田 薫 東京大学, 農学生命科学研究科, 准教授 (70183994)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | イノシトールピロリン酸 / 環境ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、これまで植物の環境応答においてほとんど解析されてこなかったイノシトールピロリン酸に着目し、その環境ストレス耐性における役割を明らかにすることを目指すものである。
(1) 生化学的解析：当初、OsKCS1～6を大腸菌で発現させ、回収したリコンビナントタンパク質を用いてin vitroで酵素活性を調べるという計画を立てていたが、６種類の遺伝子全てで、大腸菌で高発現させることが困難な状況にある。一方、イネ種子抽出物の高濃度ポリアクリルアミド電気泳動法によるイノシトールピロリン酸の分離・検出方法を確立することに成功した。
(2) 逆遺伝学的解析：６種類のOsKCS1~6に対応する発現抑制組換えイネを作出し、塩ストレス試験を行ったが、野生型イネとの差は明確ではなかった。そこで、遺伝子の系統樹解析から明らかになった３つのグループ(OsKCS1,2)(OsKCS3,4,5)(OsKCS6)それぞれに共通のDNA配列をもとに、グループごとに発現を抑制できるRNAiコンストラクトを作成した。現在、形質転換イネを作成中である。一方、OsKCSの高発現組換えイネの発芽試験からは、野生型に較べてABA感受性が高い系統や塩ストレス感受性が高い系統を同定することができた。
(3) 遺伝学的解析：２種類の低フィチン酸変異体の原因遺伝子を相補性実験から同定することに成功した。さらに、変異体と野生型種子に含まれるイノシトールピロリン酸量に差が見られることを明らかにした。
(4) 分子生物学的解析：RT-PCR解析から、塩ストレスに応答するOsKCSを明らかにした。また、OsKCS1～6のプロモーター領域をGUS遺伝子に連結させたコンストラクトを導入した組換えイネを作出し、植物体での発現部位を詳細に明らかにした。その結果、遺伝子間の発現部位にほとんど差は見られないことが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では、イネのKCS1~6の環境ストレス応答における機能を明らかにする目的で、(1)生化学的解析、(2)逆遺伝学的解析、(3)遺伝学的解析、(4)分子生物学的解析を進めることとしたが、以下のような理由から、やや遅れていると判定した。
(1)生化学的解析：当初、OsKCS1～6を大腸菌で発現させ、回収したリコンビナントタンパク質を用いてin vitroで酵素活性を調べるという計画を立てていた。しかし、コンストラクトを作成し、大腸菌に導入して発現を誘導したが、６種類の遺伝子全てで、大腸菌で高発現させることができなかった。導入コンストラクト、大腸菌の生育条件、および発現誘導方法など様々な工夫を加えたものの、高発現の実現に至っていない。この点が、本研究の進展が遅れていると判定した大きな理由である。
(2)逆遺伝学的解析：OsKCS1～6の発現抑制組換えイネと高発現組換えイネの作出とストレス試験は順調に進んでいる。しかし、発現抑制組換えイネでは、個々に遺伝子の発現を抑制しても表現型が出ないことがわかってきた。そこで、OsKCSのグループごとの発現抑制組換えイネを用いる実験へと方向を転換させることにした。この点が研究の若干の遅れにつながったが、新たな発現抑制組換えイネの作出は順調に進んでおり、新年度で遅れを取り戻すことができると考えている。
(3)遺伝学的解析：２種類の低フィチン酸変異体の相補実験という当初の計画に加え、イノシトールピロリン酸の検出方法（高濃度ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）が確立できたので、今後、変異体を用いてストレス耐性とイノシトールピロリン酸量との関係を明らかにしていくことができるものと期待され、この部分の研究は順調に進展していると判断した。
(4)分子生物学的解析：この部分の研究も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度に開始した(1)生化学的解析、(2)逆遺伝学的解析、(3)遺伝学的解析、(4)分子生物学的解析の４種類の解析を、平成27年度も続けて行なうが、いくつかの点を修正して進める。
(1)生化学的解析：リコンビナントタンパクでの酵素活性測定の実現が厳しいので、様々な組換えイネを材料として、ポリアクリルアミドゲルでの分離と検出、GC-MS解析による物質の同定の方法を確立していく。
(2)逆遺伝学的解析：OsKCS1～6高発現体を用いて、塩ストレス応答やABA応答の違いをより詳細に解析する。発現抑制組換えイネを用いる実験はアンチセンス導入系統を用いる実験から、系統樹のcladeごとにRNAiにより発現抑制する実験に切り替える。RNAi発現抑制系統の後代を育成してホモ系統を選抜し、OsKCS1と2を同時に発現抑制した場合、 OsKCS3~5を同時に発現抑制した場合、OsKCS1~5を同時に発現抑制した場合、およびOsKCS6を発現抑制した場合において、塩ストレス応答に差異が見られるか調査を開始する。
(3)遺伝学的解析：２種類の低フィチン酸突然変異体を用い、イノシトールピロリン酸量とABA感受性、塩ストレス応答との関係を明らかにしていく。
(4)分子生物学的解析：塩ストレス応答やABA応答に違いの見られた系統間での遺伝子発現の際を検出する実験を新たに計画する。
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