出芽酵母における多様性創出ゲノム工学技術の開発

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26660066
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 原島 俊 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70116086)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 杉山 峰崇 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80379130) ; 笹野 佑 大阪大学, 工学(系)研究科(研究院), 助教 (90640194)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2016-03-31
• Keywords: 酵母 / ゲノム工学 / 多様性創出工学 / ゲノム育種

Outline of Annual Research Achievements

物質生産に最適なゲノムを「ベストゲノム」と定義すれば、これからの微生物育種における最大の課題は、ベストゲノムがいかなるものかを明らかにすることであろう。この問題に答えるため、本研究では、申請者らが開発してきた酵母のゲノム工学を駆使して、天文学的な種類のゲノム組成を持つ出芽酵母細胞集団を創出し、そこからベストゲノムを持つ細胞をスクリーニングする「多様性創出ゲノム工学技術」の開発を目指す。このため、ひとつは、i)体細胞分裂で脱落可能な染色体領域を、申請者らが開発した染色体分断技術（PCS法）によりゲノムワイドに人工染色体化し、その多様な組合わせの脱落によって多様性を創出する（ゲノムの再編成技術；計画１）を発展させる。もうひとつには、ii) 全ゲノムをカバーする200kbの大きさの人工染色体を作成し、多様な組合わせで細胞に導入する（ゲノムの再構成技術；計画２）技術の可能性を検討する。平成26年度は、前者については、そのハイスループット化を、また後者については、200kbの染色体がどの程度の組合わせで、細胞に導入できるかを検討した。
計画１では、これまでのPCS技術では１カ所でしか成功していなかった染色体の分断が、PCS法に、近年発展してきたゲノム編集技術（CRISPR/ Cas）を融合することにより、異なる染色体上であろうと、同一染色体上であろうと、同時に２カ所の分断を行うことに成功した。計画２については、核融合欠損 kar1変異株で起こる chromoduction の現象を利用することにより、200kb人工染色体を持つ持つ2株の交雑により、2種の200kb人工染色体を同時に持つ株を作成することができた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

計画１）のゲノムの再編成技術による多様性創出については、PCR技術に、ゲノム編集技術CRISPR/Casを融合させることによって、ハイスループット化の見通しがついた。今後は、同時３カ所分断、同時４カ所分断等が、同一染色体上で、あるいは異なる染色体上で可能かどうかについて検討し、さらなるハイスループットが可能かどうかを検証する予定である。
一方、計画２）のゲノム再構成技術については、kar1変異を利用して、２種の200kb人工染色体を併せ持つ菌株を育種することができたものの、このプロセスを繰り返し、種々の200kb領域を持つ多様なゲノム組成を持つ細胞を構築することは、手間と時間がかかることを実感した。また、当初計画した、１倍体ゲノムをカバーする62種の200kb人工染色体をパルスフィールドゲル電気泳動によって単離し、それを色々な組み合わせで、細胞に導入する戦略も困難であろうと想像された。従って、計画２）については、方法論の変更、あるいは方針の変更が必要であると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

ゲノムの再編成技術によるゲノムの多様性創出については、その効率的な適用に必要な染色体分断のハイスループット化に、ゲノム編集技術であるCRISPR/Casを染色体分断技術PCSに融合させることによって可能であるとの見通しがついた。従って、来年度は、これを継続、発展させるつもりである。具体的には、同一染色体上あるいは異なる染色体上の複数箇所（できるだけ多くの部位）の同時分断技術の確立を目指す。
一方、ゲノムの再構成技術による多様性創出については、200kbの人工染色体を、自在な組合わせで保有する細胞を、Chromoductionによる方法で作成することは、手間と時間の問題で困難であると想像された。しかし、上記２つのアプローチのどちらをも同時に成功させる必要は無いので、熟慮した結果、今後はゲノムの再編成技術に集中したいと考えている。
そのための今後の研究の推進方策としては、染色体分断技術の更なるハイスループット化を目指すとともに、染色体２領域、あるいは３領域の同時削除、同時重複技術の確立も目指す。この目的は、染色体分断による人工染色体の創出と、その後の多様な組合わせの脱落を介したゲノムの多様性創出という２ステップの方法論だけでなく、１ステップの形質転換で、種々の染色体領域の削除や重複の組み合わせを可能にするためである。しかし、その組み合わせ数を考えると、このアプローチが真に有効であるためには、少なくとも５領域程度について、同時削除、同時重複が可能になる必要があろう。従って、同時削除、同時重複については、その限界を見極めることは必要である。ただ、これまでの成果によって、削除、あるいは重複により、バイオテクノロジーに有用な形質が現れる染色体領域を明らかにしているので、こうした領域の２つあるいは３つの組み合わせを持つ細胞の創成が可能になるだけでも、有用な技術になると考えている。

Remarks

研究代表者の原島　俊は、阪大を定年退職し、４月１日より崇城大学に移動した。

Research Products

• [Journal Article] Cloning and functional analysis of HpFAD2 and HpFAD3 genes encoding Δ12- and Δ15-fatty acid desaturases in Hansenula polymorpha. (2014)
  • Author(s): Sangwallek, J., Kaneko, Y., Tsukamoto, T., Marui, M., Sugiyama, M., Ono, H., Bamba, T., Fukusaki, E., Harashima, S.
  • Journal Title: GENE Volume: 533 Pages: 110-118
  • DOI: doi: 10.1016/j.gene.2013.09.115.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Suppression mechanism of the calcium sensitivity in Saccharomyces cerevisiae ptp2Δmsg5Δ double disruptant involves a novel HOG-independent function of Ssk2, transcription factor Msn2 and the protein kinase A component Bcy1. (2014)
  • Author(s): Lavina, W., Shahsavarani, H., Saidi, A., Sugiyama, M., Kaneko, Y., Harashima, S.
  • Journal Title: J. Biosci. Bioeng. Volume: 117 Pages: 135-141
  • DOI: doi: 10.1016/j.jbiosc.2013.06.022
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nuclear localization of Haa1, which is linked to its phosphorylation status, mediates lactic acid tolerance in Saccharomyces cerevisiae. (2014)
  • Author(s): Sugiyama, M., Akase, SP., Nakanishi, R., Horie, H., Kaneko, Y., Harashima, S.
  • Journal Title: Appl. Environ. Microbiol. Volume: 80 Pages: 3488-3495
  • DOI: doi: 10.1128/AEM.04241-13
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Genome-wide mapping of unexplored essential regions in the Saccharomyces cerevisiae genome: evidence for hidden synthetic lethal combinations in a genetic interaction network. (2014)
  • Author(s): Kaboli, S., Yamakawa, T., Sunada, K., Takagaki, T., Sasano, Y., Sugiyama, M., Kaneko, Y., Harashima, S.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 42 Pages: 9838-9853
  • DOI: . doi: 10.1093/nar/gku576
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effects of deletion of different PP2C protein phosphatase genes on stress responses in Saccharomyces cerevisiae. (2014)
  • Author(s): Sharmin, D., Sasano, Y., Sugiyama, M., Harashima, S.
  • Journal Title: Yeast Volume: 31 Pages: 393-409
  • DOI: doi: 10.1002/yea.3032.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 多様性創出ゲノム工学技術の開発と微生物育種への応用 (2014)
  • Author(s): 笹野 佑、Yeon-Hee Kim、杉山 峰崇、原島 俊
  • Journal Title: 生物工学会誌 Volume: 92 Pages: 589-592
  • Peer Reviewed
• [Presentation] CRISPR-PCS法による酵母染色体複数部位の同時分断 (2014)
  • Author(s): 笹野 佑、長澤宏器、Saeed Kaboli、杉山峰崇、原島 俊
  • Organizer: 日本生物工学会第66回大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-11
• [Presentation] ゲノムエンジニアリングによる出芽酵母二倍体ゲノムの部分一倍体化と育種への応用 (2014)
  • Author(s): 砂田啓輔、Saeed Kaboli、宮本哲也、笹野 佑、杉山峰崇、原島 俊：
  • Organizer: 日本生物工学会第66回大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-11
• [Presentation] ゲノムシャフリングによる出芽酵母の高温耐性の改良と高温アルコール発酵 (2014)
  • Author(s): 杉山峰崇、呉 俊元、Badua Mark Anthony A.、笹野 佑、金子嘉信、原島 俊
  • Organizer: 日本生物工学会第66回大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-11
• [Presentation] 高温耐性出芽酵母C3723株におけるCDC19-C遺伝子による高温性獲得機構」 (2014)
  • Author(s): Wang Kun、○木村駿太、笹野 佑、杉山峰崇、原島 俊
  • Organizer: 日本生物工学会第66回大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-11
• [Presentation] 酵母を用いた真核生物遺伝子機能の解明とバイオテクノロジーへの応用 (2014)
  • Author(s): 原島 俊
  • Organizer: 日本生物工学会第66回大会
  • Place of Presentation: 札幌コンベンションセンター（札幌市）
  • Year and Date: 2014-09-09 – 2014-09-11
  • Invited
• [Presentation] 酵母バイオテクノロジーの発展とともに40年 (2014)
  • Author(s): 原島 俊
  • Organizer: 第21回酵母合同シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京大学 伊藤国際学術研究センター 伊藤謝恩ホール（東京都）
  • Year and Date: 2014-09-03 – 2014-09-04
  • Invited
• [Presentation] ゲノム工学技術を用いた出芽酵母新規合成致死遺伝子の探索 (2014)
  • Author(s): 高垣太緒、Saeed Kaboli、砂田啓輔、山川卓也、笹野 佑、杉山峰崇、原島 俊
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム第47回研究報告会
  • Place of Presentation: 東京大学弥生講堂（東京都）
  • Year and Date: 2014-09-01 – 2014-09-02
• [Presentation] Segmental haploidization of diploid genome in Saccharomyces cerevisiae and its application to breeding (2014)
  • Author(s): Saeed Kaboli、Tetsuya Miyamoto、Keisuke Sunada、Yu Sasano、Minetaka Sugiyama、Satoshi Harashima
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム第47回研究報告会
  • Place of Presentation: 東京大学弥生講堂（東京都）
  • Year and Date: 2014-09-01 – 2014-09-02
• [Presentation] 出芽酵母におけるミニ染色体のワンステップ作成技術の開発 (2014)
  • Author(s): 長澤宏器、笹野 佑、Saeed Kaboli、杉山峰崇、原島 俊
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム第47回研究報告会
  • Place of Presentation: 東京大学弥生講堂（東京都）
  • Year and Date: 2014-09-01 – 2014-09-02
• [Presentation] 過剰発現で乳酸耐性を付与する出芽酵母転写活性化因子Haa1の機能解析 (2014)
  • Author(s): 中西良太、堀江仁志、松田祐典、笹野 佑、杉山峰崇、原島 俊
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム第47回研究報告会
  • Place of Presentation: 東京大学弥生講堂（東京都）
  • Year and Date: 2014-09-01 – 2014-09-02
• [Presentation] 高温耐性出芽酵母C3723株におけるCDC19-C遺伝子による高温耐性化 (2014)
  • Author(s): 木村駿太、王 琨、○笹野 佑、杉山峰崇、原島 俊
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム第47回研究報告会
  • Place of Presentation: 東京大学弥生講堂（東京都）
  • Year and Date: 2014-09-01 – 2014-09-02
• [Presentation] ゲノムシャフリングによる出芽酵母高温耐性の改良と高温アルコール発酵 (2014)
  • Author(s): 杉山峰崇、呉 俊元、Badua Mark Anthony A.、中西良太、笹野 佑、金子嘉信、原島 俊
  • Organizer: 酵母遺伝学フォーラム第47回研究報告会
  • Place of Presentation: 東京大学弥生講堂（東京都）
  • Year and Date: 2014-09-01 – 2014-09-02
• [Book] Development and application of novel genome engineering technology in Saccharomyces cerevisiae, IN Microbial production -From genome design to cell engineering-, Microbial Production (2014)
  • Author(s): Sasano Y, Sugiyama M. Harashima S. (2014)
  • Total Pages: 555
  • Publisher: Springer,
• [Remarks] 大阪大学大学院工学研究科ゲノム機能工学研究室（原島研究室）
  • URL: http://www.bio.eng.osaka-u.ac.jp/mg/