2014 Fiscal Year Research-status Report
骨形成における小胞体カウンターイオンチャネルの機能的役割
| Project/Area Number |
26670028
|
|---|
| Research Institution | National Institute of Health Sciences |
|---|
Principal Investigator |
山崎 大樹 国立医薬品食品衛生研究所, 薬理部, 主任研究官 (40467428)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
駒崎 伸二 埼玉医科大学, 医学部, 准教授 (80129155)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | TRICチャネル / 骨芽細胞 / 破骨細胞 / 骨形成不全症 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、サウジアラビアおよびイスラエルの家系にてTMEM38B (TRIC-B)がヒト骨形成不全症の原因遺伝子として新たに同定されたことから、骨形成不全症の発症原因と考えられる変異型ヒトTRIC-Bタンパク質によるTRIC-B機能低下の原因を生化学的および電気生理学的アプローチにより解明を試みた。まず、コムギ無細胞発現系により変異型ヒトTRIC-Bタンパク質を精製し、化学架橋試薬による多量体形成能を検討した。その結果、変異型であっても正常型と同様に3量体形成能を有することが明らかとなった。現在は、変異型ヒトTRIC-Bタンパク質を人工脂質二重膜へ再構成し、電気生理学的解析を実施すべく、精製条件の検討を行っているところである。
また、呼吸不全により新生致死を示すTRIC-B欠損マウスにおいても骨形成不全症の表現型が肋骨や大腿骨にて観察されたことから、骨形成不全症の原因細胞として可能性のある骨芽細胞または破骨細胞の関与を明らかにしつつ、原因細胞を単離・培養しヒトでのTRIC-B機能低下あるいはマウスにおけるTRIC-B欠損による骨形成不全症の発症メカニズムを明らかにすることを試みた。胎生17.5日からP0までのマウス大腿骨に対してアリザリンレッド染色およびALP染色、TRAP染色など詳細な組織学的解析を行ったところ、胎生期よりすでに骨形成の遅延が生じており、かつTRAP陽性細胞の海綿骨における分布もTRIC-B欠損マウスにて異常であることが示された。従って、骨芽細胞と破骨細胞のいずれの細胞においても何らかの異常を有している可能性が考えられたため、それぞれの細胞を単離・培養し、遺伝子発現や細胞機能について検討した。さらに破骨細胞においては、単離・培養を開始したところであり、細胞数・細胞あたりの核数・大きさ等の定量や、破骨細胞にてすでに観察されることが明らかとなっているカルシウムオシレーションについても検討することを予定している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
変異型ヒトTRIC-Bタンパク質の電気生理学的解析は精製したタンパク質の精製度が不十分であるため電気生理学的解析に至っていない状況であるが、骨形成不全症発症メカニズムの解明については様々な染色による詳細な組織学的解析をすでに終了しており、骨芽細胞および破骨細胞のいずれの細胞においても異常が観察されている。これを受けて、2種類の細胞の単離・培養系を立ち上げ、まずはそれぞれ単独での遺伝子発現や細胞機能の解析を行っている。TRIC-B欠損骨芽細胞においてERストレスマーカー遺伝子の発現上昇は、大腿骨の電子顕微鏡観察により膨潤化した小胞体が多数観察されたことからも予測できたが、何故小胞体が膨潤化するのかは現在のところ不明である。これを明らかにするため、マイクロアレイを実施中である。また、破骨細胞の単離・培養では、きちんとした結果はまだ出てないが、定量的な解析を行い野生型とTRIC-B欠損細胞との違いを明らかにすることを目指している。このように当初研究実施計画として予定した進捗状況であり、組織学的解析については埼玉医科大学の駒崎先生を分担研究者として実施していただいたが、平成26年度で解析が終了したことから分担研究者の変更を行った。
以上より、おおむね順調に進行していると言える。
|
| Strategy for Future Research Activity |
変異型ヒトTRIC-Bタンパク質を人工脂質二重膜へ再構成し電気生理学的解析を実施すべく、精製条件の検討を行っており、ウェスタンブロット等でかなりの精製度であっても人工脂質二重膜へ再構成するとクロライドチャネルの混入が避けられず、TRIC-Bチャネルのみの電流を測定できる状態には至っていない。平成27年度は様々な条件を試し、TRIC-Bの電流のみを測定できる条件をできるだけ早く見出す予定である。
骨形成不全症発症メカニズムの解明について平成27年度は、平成26年度に引き続き各細胞の単離・培養系において細胞機能の解析を行う。骨芽細胞においてはERストレスマーカーおよびIL-6遺伝子の発現上昇の原因の解明を目指すとともに、骨形成および骨芽細胞機能として重要なコラーゲンの産生・分泌、さらにはTRIC-Bの機能として重要な細胞内カルシウム制御についての検討を行う。また、破骨細胞についてもTRAP染色や、象牙質切片上でのピット形成を評価することで破骨細胞の骨吸収機能を評価する。さらにはすでに破骨細胞にて観察されることが報告されているカルシウムオシレーションについても定量的な解析を行い、野生型とTRIC-B欠損細胞との差異を見出し、最終的には骨芽細胞と破骨細胞の複合的な異常により骨形成異常が生じているかどうかを明らかにする。
変異型ヒトTRIC-Bタンパク質の精製条件の検討についても並行して進め、電気生理学的解析を行うことを目指す。
|
| Causes of Carryover |
平成26年度の研究実施内容としては、分担研究者であった埼玉医科大学の駒崎先生や共同研究を実施している先生方に結果を出してもらったものがほとんどであり、申請者の所属研究室で実施したものはほとんど無かった。そのため、次年度使用額が大きく生じたものと考えられる。また、申請者自身が1月より所属機関が変更となり、変更直前の12月は予算の移動のため、変更直後からしばらくは新規所属機関での予算執行システムの理解不足により予算執行が困難であった。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成27年度には、2種類の細胞単離・培養が本格的に始まり、細胞機能アッセイやカルシウムイメージング、または網羅的マイクロアレイ解析の実施を予定しているため、細胞培養関連の消耗品、イメージングのための色素の購入やマイクロアレイの委託費に充てる計画である。
|
