2014 Fiscal Year Research-status Report
マイクロ流路－FISH法による水環境中の病原細菌のon-siteモニタリング
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26670062
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
山口 進康 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (20252702)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
一條 知昭 大阪大学, 薬学研究科(研究院), 助教 (20513899)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | オンサイト・モニタリング / 危害微生物 / 水環境 / マイクロ流路デバイス / 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
蛍光 in situ ハイブリダイゼーション（FISH）の反応を進めるにあたっては、「菌体の固定 → 固定液の除去 → 蛍光プローブの添加 → ハイブリダイゼーション → 洗浄 → 検出」等の一連の操作が必要である。すなわち、①ホルマリンの添加による菌体の固定、②遠心操作によるホルマリンの除去、③蛍光プローブの添加、④等温条件下でのハイブリダイゼーション、⑤蛍光プローブの除去、⑥蛍光シグナルの検出を行う必要がある。特にFISHにおいては、菌体の固定操作が重要であるが、この固定液が以降の反応を阻害する。そこで、溶液交換を行わずにハイブリダイゼーションを進めるために、固定液の濃度と固定時間を最適化し、除去することなく反応を進めるための検討を行った。
まずホルマリン濃度を上げた場合は、固定時間が短くなるものの、FISH反応が阻害された。そこで、ホルマリン濃度を下げたところ、FISH反応が阻害されず、良好な蛍光シグナルを得ることができた。
今回の検討により、固定液を除去することなく、溶液中でFISH反応を行うことが可能となり、マイクロ流路デバイスを用いたFISH（on-chip FISH）法の課題の一つが解決した。今後は人工核酸等を用いた蛍光プローブの検討とともに、蛍光プローブの標識法の検討も進め、on-chip FISH法のプロトコールを作成する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛍光 in situ ハイブリダイゼーションをマイクロ流路デバイスを用いて行う際に解決すべき課題である「溶液交換を行わない固定法」を確定することができた。一方、独自に作製したマイクロ流路システムのフォーカス部分にトラブルが発生し、その解決に時間を要したために、研究の進展が一部遅れた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、平成26年度の研究成果をふまえて、標準菌株を用いてon-chip FISH法のプロトコールを作成するとともに、水環境を対象とした危害微生物モニタリングを実施する。また同時に、環境中の微小な細菌を検出するための蛍光プローブの検討も進める。
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| Causes of Carryover |
独自に作製したマイクロ流路システムのフォーカス部分に故障が発生し、高精度な測定ができなくなった。その解決に数ヶ月の時間を要したため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究計画に従い、FISH反応をマイクロ流路デバイスを用いて行うための検討を進める。
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