2015 Fiscal Year Research-status Report
未分化上皮細胞選択的スプライシングによる多機能性発現の分子基盤
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26670104
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| Research Institution | Fukuoka Dental College |
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Principal Investigator |
山崎 純 福岡歯科大学, 歯学部, 教授 (50230397)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八田 光世 福岡歯科大学, 歯学部, 講師 (30344518)
岡村 和彦 福岡歯科大学, 歯学部, 准教授 (00224056)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | スプライシング / 上皮細胞 / クロライドチャネル / 分化 / ミニジーン / 表皮 / 3次元培養 / エピジェネティックス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はCa2+活性化Cl-チャネル調節分子CLCAの局在・機能をこれまでに報告してきたが、近年未分化上皮に特異的に発現する短縮型アイソフォーム（CLCA-t）を見出した。未分化・分化の違いで異なるスプライシング制御因子による択一的スプライシングの変化が考えられたため、スプライシング機構を明らかにするために、CMVプロモーター、FLAG タグ、exon 8～10までの遺伝子領域（minigene）とその下流にGFPを連結したCLCA遺伝子スプライシング・レポータープラスミドを開発した。HEK293細胞へ遺伝子導入したところ、GFP、FLAGならびにCLCA-t配列をもつタンパク（exon 8+10）がWestern blot法により確認された。他方、FLAGのみで標識されるタンパク（exon 8+9+10）のごく僅かな発現が認められた。平成27年度には、マウス角化細胞株Pam212でCLCAスプライシングアイソフォームの変換を検討したところ、exon 8+10のパターンが検出されたがexon 8+9+10 は検出されなかった。Ca2+ 濃度を0.05 mMから1 mM以上へ増加させてPam212の分化を促進しても（ケラチン1と10の発現増加）、exonの発現パターンには影響を与えなかった。これらの結果は、CLCAアイソフォームの変換は平面培養でのCa2+濃度の切替えでは十分に起こらず、3次元的に重層化することによる生理的な分化度の変化が重要なのではないかと推察された。そこで、適切な重層構造を呈するヒトケラチノサイト株を改めて選定し直したので、その条件下でスプライシングスイッチを現在検討しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
スプライシング機構を明らかにするために、CMVプロモーター、FLAG タグ、exon 8～10までのminigene、GFPを連結したCLCA遺伝子スプライシング・レポータープラスミドを細胞へ遺伝子導入し、異なるアイソフォームの発現をWestern blottingにより確認することができた。しかしながら、CLCAアイソフォームの変換は平面培養でのCa2+濃度の切替えでは十分に起こらなかったため、レイヤー構造内の細胞局在における分化度の違いが重要であるのではないかと推察された。比較的に容易に遺伝子導入が可能な株化細胞（Pam212細胞やHaCaT細胞）において、nativeな組織に遜色がない重層化ができれば理想的であったが、その重層化と角化のパターンは皮膚由来初代細胞を用いたものとは明らかに異なっていた (Hiromatsu et al., 2015)。これらの株化細胞では分化度に応じた発現スイッチを検討するには不適切であるため、3次元培養で上皮分化を評価できる細胞株を選定するのに時間を要した。昨年度に、適切な重層構造を呈するヒトケラチノサイト株を入手したので、現在その細胞株を用いてスプライシングスイッチを検討しているところである。
スプライシング・レポータープラスミドの導入効率が表皮細胞株では著しく劣るため、HEK293細胞の場合とは異なる導入方法（リポフェクション法、エレクトロポレーション法など）を様々検討したが、かなり良好なトランスフェクション試薬を見出すことができた。
なお、昨年度始めから研究協力者として加藤健一氏から本プロジェクト研究補助と発表において協力を得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
スプライシング・レポータープラスミドを分化を評価できるケラチノサイト株へ導入後、3次元培養法で得られた分化または未分化のレイヤーにおけるスプライシングスイッチの検討を行う。具体的には、
(1) 重層化過程におけるスプライシングアイソフォームの発現の推移
(2) 重層化の完成後の各レイヤーにおけるスプライシングアイソフォームの局在
の結果をまとめる。
さらに、polycomb複合体阻害薬の効果に絞ってスプライシング選択が影響を受けるか否かを検討して、未分化・分化の違いによるスプライシング部位の変化がエピジェネティック制御（ヒストン修飾）を介する可能性を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
本年度の結果から、3次元培養でのスプライシングの切り替えを検討する必要に迫られために、レポーター実験への展開が遅れて次年度使用額が生じるに至った。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
最終年度は表皮細胞株を用いての3次元培養で、分化または未分化のレイヤーにおけるスプライシング・レポーター実験を完了する予定である。また、エピジェネティック制御（クロマチン修飾）による関与についての研究も合わせて実施していく。これらの計画を遂行するために、当該の繰越金と次年度の予定額をあわせて使用する。
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Research Products
(8 results)
