2016 Fiscal Year Research-status Report
未分化上皮細胞選択的スプライシングによる多機能性発現の分子基盤
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26670104
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| Research Institution | Fukuoka Dental College |
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Principal Investigator |
山崎 純 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 教授 (50230397)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
八田 光世 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 准教授 (30344518)
岡村 和彦 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 准教授 (00224056)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | スプライシング / 上皮細胞 / クロライドチャネル / 分化 / エピジェネティックス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はCa2+活性化Cl-チャネル調節分子CLCAの未分化上皮に特異的に発現する短縮型アイソフォーム（CLCA-t）を見出した。スプライシング機構を明らかにするために、exon 8～10までの遺伝子領域（minigene）とその下流にGFPを連結したCLCA遺伝子スプライシング・レポータープラスミドを作成した。HEK293細胞へ遺伝子導入したところ、exon 8+10の発現とexon 8+9+10のごく僅かな発現が認められた。重層化上皮での機構を検討するために、マウス角化細胞株Pam212に遺伝子導入したところ、exon 8+10は検出されたが、exon 8+9+10 は検出されなかった。Ca2+ 濃度を0.05 mMから1 mM以上へ増加させてPam212の分化を促進させたが、CLCAスプライシングには影響を与えなかった。また、線維芽細胞株を含むコラーゲンゲル上でPam212を3次元培養しても適切な重層構造が見られなかった。他方、ヒト由来口腔粘膜上皮細胞株OKF6/TERT2株では、Ca2+ 濃度の増加による分化マーカーであるケラチンの発現パターンの変化が確認された。さらに、3次元的に培養を行なうと適切な重層構造を呈することが明らかになったため、3次元培養条件下でのスプライシングスイッチを見る良い細胞系であろうと考えられた。この上皮細胞株にminigeneを安定的に発現させ、Ca2+ 濃度変化によるスプライシングスイッチを検討しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
スプライシング機構を明らかにするために、exon 8～10までのminigeneからなるCLCA遺伝子スプライシング・レポータープラスミドを細胞へ遺伝子導入したが、CLCAアイソフォームの変換は平面培養でのCa2+濃度の切替えでは十分に起こらなかった。レイヤー構造内の上皮細胞の分化度の違いがスプライシングに重要であるのではないかと推察された。比較的に容易に遺伝子導入が可能な株化細胞（Pam212細胞やHaCaT細胞）を用いた3次元培養では、重層化と角化のパターンが皮膚由来初代細胞とは異なっていた。そこで、ヒト由来口腔粘膜上皮細胞株OKF6/TERT2株の供与を受け3次元培養を試みると、重層化と角化が適切なパターンであることを確認できた。その細胞株を用いてminigeneを安定的に発現する株の構築に時間がかかったが、研究期間を延長してスプライシングスイッチを検討しているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
スプライシング・レポータープラスミドで上皮分化を評価できるOKF6/TERT2株への導入後、3次元培養法で得られた分化または未分化のレイヤーにおけるスプライシングアイソフォームの発現の結果をまとめる。さらに、polycomb複合体阻害薬の効果に絞ってスプライシング選択が影響を受けるか否かを検討して、未分化・分化の違いによるスプライシング部位の変化がエピジェネティック制御（ヒストン修飾）を介する可能性を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
研究期間を延長するため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
研究成果の纏めのために残り全額を使用する。
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