2015 Fiscal Year Research-status Report
真に機能的な転写因子複合体の精製とその構成因子の機能解析
| Project/Area Number |
26670136
|
|---|
| Research Institution | Shiga University of Medical Science |
|---|
Principal Investigator |
縣 保年 滋賀医科大学, 医学部, 教授 (60263141)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
|
| Keywords | E2A / 転写因子 / 染色体高次構造 / 3D-FISH / Immuno-FISH / 3C assay / 転写因子 foci / 転写因子ファクトリー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
細胞分化における遺伝子発現の変化には、染色体のルーピングによってエンハンサーとプロモーターが接近することが重要であることが明らかにされつつある。我々は抗原受容体遺伝子の再構成を対象に研究を行い、E2A転写因子が染色体ルーピングを介して組換えを誘導することや、その際E2Aが核内でdot状の構造体（focus）を形成することを明らかにしてきた。
そこで本研究では、E2Aがこのdot状構造体を足場として染色体のループ構造を形成し、組換えを誘導する可能性を想定し、その分子機構を明らかにすることを目的として、E2Aとクロマチン上で相互作用する真に機能的な複合体をChIP条件下で精製し、質量分析によって構成因子を同定することを計画した。そのためには、均一で比較的多数の細胞が必要であり、通常は適した細胞株に目的遺伝子を安定的に発現させた細胞を用いるが、T細胞受容体遺伝子の再構成に伴う染色体構造変化を誘導できる細胞株は存在しないため、組換え酵素であるRAG2ノックアウトマウスの胸腺細胞を用いる予定であった。しかしながら、当該マウスの繁殖に問題が生じ、解析に必要と思われる個体数（30-50匹程度）を得ることが困難であった。
そこでT細胞系の細胞株を多数解析し、E2Aが核内でdot状の構造体を形成し、さらにその細胞株で発現しているE2Aの標的遺伝子が、E2Aのdot状構造体に近接するものを選択した。それらの細胞株を用いてE2Aとクロマチン上で相互作用する機能的な複合体をChIP条件下で精製し、質量分析を行いその構成因子を複数同定した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
上述のように、E2Aとクロマチン上で相互作用する真に機能的な複合体をChIP条件下で精製し、質量分析によって構成因子を同定することを計画していたが、そのために使用する予定であったRAG2ノックアウトマウスの繁殖に問題が生じ、解析に必要と思われる個体数を得ることが困難であった。そこで次善の策として、T細胞系の細胞株を用いることを考え、多くのT細胞系細胞株をスクリーニングし、E2Aが核内でdot状の構造体を形成し、さらにその細胞で発現しているE2Aの標的遺伝子をプローブとしてImmuno-3D-FISHを行い、それらの遺伝子が、E2Aのdot状構造体に近接するものを選択した。それらの細胞株を用いてE2Aとクロマチン上で相互作用する機能的な複合体をChIP条件下で精製し、質量分析を行いその構成因子を複数同定した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
T細胞系細胞株のうち、E2Aが核内でdot状の構造体を形成し、その細胞で発現しているE2Aの標的遺伝子がE2Aのdot状構造体に近接する細胞株を用いて、E2Aの機能的な複合体をChIP条件下で精製し、質量分析を行いその構成因子を複数同定した。そこで、同定できた構成因子のうち、E2Aのdot状構造体と共局在するものに絞り込みをかけるとともに、ChIPを行い実際にE2Aと共沈するか確認する。E2Aのdot状構造体と共局在し、E2Aと共沈する因子について、miRNAによるノックダウンを行ない、E2Aのdot状構造体の形成に影響がないか、さらにE2Aの標的遺伝子のE2A dot状構造体との接近状態や発現レベルに影響がないか等の解析を行なう。
ノックダウンによって、E2Aのdot状構造体の形成や、E2Aの標的遺伝子とE2A dot状構造体との接近状態や発現レベルに影響が認められた因子について、抗原受容体遺伝子の組換えにも関与するか、マウス胸腺細胞を用いて解析を行なう。
|
| Causes of Carryover |
今年度は、E2Aと機能的な複合体を構成する因子の機能解析を計画していたが、前年度に予定していた、RAG2ノックアウトマウスの胸腺細胞を用いたE2Aの機能的複合体の精製と質量分析が、当該マウスの繁殖に問題が生じ、解析に必要と思われる個体数を得ることが困難であり、実施できなかった。しかしながら、多くのT細胞系細胞株をスクリーニングした結果、E2Aのdot状構造体が機能的であると考えられる細胞株が得られたため、今年度それらの細胞株を用いてE2Aの機能的な複合体を精製し、質量分析によって構成因子を同定することができた。その結果、次年度E2Aの機能的複合体の構成因子の機能解析が実施できることになったため。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
同定できた構成因子のうち、E2Aのdot状構造体と共局在するものに絞り込みをかけるとともに、ChIPを行い実際にE2Aと共沈するか確認する。E2Aのdot状構造体と共局在し、E2Aと共沈する因子について、miRNAによるノックダウンを行ない、E2Aのdot状構造体の形成に影響がないか、さらにE2Aの標的遺伝子のE2A dot状構造体との接近状態や発現レベルに影響がないか等の解析を行なう。
ノックダウンによって、E2Aのdot状構造体の形成や、E2Aの標的遺伝子とE2A dot状構造体との接近状態や発現レベルに影響が認められた因子について、抗原受容体遺伝子の組換えにも関与するか、マウス胸腺細胞を用いて解析を行なう。
|
