2015 Fiscal Year Research-status Report
塩基配列特異的なメチル化シトシンin situ検出法の開発
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26670176
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
北澤 荘平 愛媛大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90186239)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北澤 理子 愛媛大学, 医学部附属病院, 准教授 (00273780)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | DNAメチル化 / in situ hybridization / 錯体形成 / 組織化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
単一の受精卵に由来しながら、個体形成にいたる多様な分化を制御しているエピジェネティクス制御機構は、iPS細胞による再生医療をはじめとするポストゲノム研究の最重要課題の一つである。メチル化シトシンは、エピジェネティクス制御機構の主体をなすDNA修飾であり、細胞・組織分化や腫瘍発生・進展に重要である。本研究は、遺伝子の特定部位、特に調節遺伝子 (promoter領域)に存在するCpG-islandや、ゲノム刷り込み現象に関与する部位のメチル化シトシンを、細胞や組織の形態を保ったまま (in situ)で検出する組織化学的手法を世界に先駆けて開発することを目指すものである。
現在までに、microdissection法での検討は多いな成果を上げ、特定遺伝子のメチル化状態を形態学的な観点で選別した集団で検討することに成功し、gene silencing memoryという概念を打ち立てるに至っている。これまでは、申請者等が確立した「microdissection検体のアガロースビーズ法」を主として用いてきたが、応用研究には制約があった。当該研究は、染色体、細胞や組織構築を保ったまま(in situで)塩基配列特異的なメチル化シトシンを短時間に検出する方法の開発を目指すものである。特定塩基配列のメチル化シトシンを認識するプローブ (ICONプローブ)と組織切片・染色体上でのin situ DNA増幅法 (Padlock probe法)とを併用する新規の形態学的手法により、腫瘍をはじめとする種々の病態発生に関与するエピジェネティクス変化を高感度で特異的に検出する技術開発を目標として基礎的検討を行って、塩基特異的なメチル化シトシンの検出法のプロトコールの作成まで完成させている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
染色体、細胞組織標本上で、標的DNAのメチル化シトシンに、塩基特異的にICONプローブを結合させ、オスミウム処理による強固な錯体形成により固定化する。次ぎに、このICONプローブ配列に対するPadlock probeを結合させ、標識核酸をDNA増幅過程でとりこませ、組織化学的に検出する。この手技により、染色体や細胞、組織構築を保ったままin situで特異的な塩基配列のメチル化シトシンの有無を検出することに成功している。まず、ガラス面にスポットした核酸を標的にし、蛍光顕微鏡での観察が可能なことが確認されている。培養細胞を用いた系で条件設定を行い、単一遺伝子での塩基配列特異的なメチル化シトシンの検出、マウスの曲精細管での精子形成過程における特定遺伝子のメチル化付加の状態について組織化学法および蛍光抗体法で観察することに成功している。現在、1)ゲノム刷り込みと癌、2)再生・リプログラミングにおける脱メチル化の機構、3)発生初期におけるメチル化シトシンパターンの形成過程、および4)非CpG-island領域のメチル化による遺伝子発現制御と病理病態との関わりなどの応用研究へ展開させている。
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| Strategy for Future Research Activity |
従来の組織化学では不可能であった、遺伝子発現制御の形態学的解析、特にDNAのメチル化解析を、細胞・組織構造を保ったまま行う。これは、DNAメチル化を中心としたエピジェネティクス制御機構を形態学的研究へと広く展開させる可能性を持つ、きわめて独創的な実験方法の開発を目指すものである。申請者等は、メチル化シトシンの検出には、メチル化シトシンと相補的な位置のプローブとなるDNAの中のグアニンに標識を行い、メチル化シトシンと特異的かつ強固に結合した標識グアニンプローブを基軸として、padlock probeにより、常温でのDNA増幅法による伸展反応を行い、組織切片上で形態を温存しつつ、DNA伸展中に標式核酸をとりこませるという独創的で斬新な方法の開発を目指しており、その成果は直ちに発生学、再生医学、癌研究へと広領域に分野横断的な応用展開が期待できる。
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| Causes of Carryover |
予検討の基礎的研究がスムーズに進行し、応用研究経費に予算をより多く消費することが予想されたため、経費の一部を次年度に移行する措置をとったため
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
期間内に全ての計画研究を遂行し、必要な経費を使用する予定である。
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