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2015 Fiscal Year Research-status Report

CFB門未分類肺炎菌の滑走運動と上皮細胞付着機構に関する研究

Research Project

Project/Area Number 26670217
Research InstitutionInstitute of Physical and Chemical Research

Principal Investigator

池 郁生  国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソースセンター, 専任研究員 (40183157)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 小久保 年章  国立研究開発法人放射線医学総合研究所, 研究基盤センター, 課長 (10425663)
Project Period (FY) 2014-04-01 – 2017-03-31
KeywordsCARバチルス / Filobacterium rodentium / グラム陰性菌 / 呼吸器感染症原因菌 / マウス / ラット / ゲノム編集 / 細胞付着機構
Outline of Annual Research Achievements

CAR(カー)バチルスはマウス・ラットの呼吸器上皮に主に感染し慢性炎症を起こすフィラメント状グラム陰性桿菌である。培養が困難とされたが我々は哺乳類培養細胞の上清を用いて本菌の液体培養に成功し、CARバチルスの完全ゲノム配列を世界ではじめて決定した(全長1,439,084 bp、環状)。ゲノム解析から約1,200のコード領域が推定されたが、その3分の1は機能未知で、病原因子を始めとした多くの情報が不明である。本研究ではゲノム解析を進め、本菌遺伝子の変異株を作成し、滑走運動をモデルに本菌の上皮細胞付着因子を決定することを目的とした。
平成27年度は、ゲノム情報の解析を進めるとともに、CRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法を検討した。遺伝子改変法をトランスポゾン法から変更するための組換えDNA実験委員会承認に時間がかかった。また、実験室の空調機が長期にわたり故障してその間、遺伝子改変実験ができず、遺伝子改変実験の遂行が困難となり計画を1年間延長した(日本学術振興会申請許可済み)。現在は故障に対応し、DNA実験委員会の承認も得たため、平成28年度において研究を進めたい。
実験ができない間に本菌の学名を制定する作業を行った。理研BRC微生物材料開発室(JCM)の坂本光央研究員の協力を得て、我々が培養可能としたCARバチルスSMR-C株をJCMに寄託し、同株の塩耐性、至適生育温度、生化学性状や脂質成分分析を行い、2種類の異なる方法による16S rRNA遺伝子配列の系統樹解析を進めた。このSMR-C株が既報のいかなる細菌種とも異なる新種であることを新科・新属レベルで提案し、本菌をFilobacterium rodentiumと命名した(基準株はSMR-C)。
平成28年度は当初の目的にもどり、CRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法を使ってCARバチルスの持つ酵素遺伝子の欠損株作成を試す。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

CARバチルス変異株作成のための遺伝子改変手法について再検討し、CRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法に変更するための組換えDNA実験委員会における承認に時間が必要だった。また、実験室の空調機が故障して長期にわたりCARバチルスの遺伝子改変実験ができなかった(既に修理対応済み)。平成28年度はゲノム編集法を採用することによって効率よく遺伝子変異が導入でき、今後は変異株樹立までの時間短縮を見込むことができると考えている。

Strategy for Future Research Activity

CARバチルスSMR-C株の滑走運動分子欠損株作成のための遺伝子改変手法について、時間と労力がかかるトランスポゾン法をいったん中止して、CRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法に変更した。ゲノム編集法確立のためのトライアル候補遺伝子にはSMR-C株の持つ酵素を選び、発色反応により遺伝子の発現があることを確認した。
CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp)を用いてCas9のターゲットとなる遺伝子配列を検索し、Local BLASTでSMR-C株ゲノム内に他の相同配列が無く、制限酵素認識配列を含むものを選んだ。当該配列を用いてガイドRNAの設計を行なった。ガイドRNAは合成したものを使用し、Cas9酵素は市販のものを用いる。今後、浮遊培養したSMR-C株にエレクトロポレーションでガイドRNAとCas9酵素を導入し、液体培養で増殖したものを限界希釈して96穴プレートに分注し、レプリカを取った上で、各ウエルの酵素活性の有無を判定する。酵素活性を失ったウエル中の菌は固形培地上でクローニングして欠損株を選んだ後、当該遺伝子領域の塩基配列を決定して確認する。

Causes of Carryover

CARバチルスの滑走運動遺伝子欠損株作成のための遺伝子改変手法について再検討し、当初予定のトランスポゾン法をいったん中止してCRISPR/Cas9を利用するゲノム編集法に変更したため、組換えDNA実験委員会における承認に時間がかかり、また実験室の空調不具合のため遺伝子改変実験が長期にわたってできず、計画遂行が平成28年度にずれこんだため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

CRISPR/Cas9関連試薬購入、菌の培養観察に必要な培養器や培地類の購入等に用いる予定である。Cas9認識配列およびガイドRNA作成用のDNAは人工遺伝子で作成する。Cas9は酵素そのものを用いる。SMR-C株へのガイドRNAならびにCas9酵素の導入はエレクトロポレーションで行なう。

Remarks

CARバチルス SMR-C株に新科・新属・新種としてFilobacterium rodentiumという学名を付けた論文が採択されたため、プレス発表した。

  • Research Products

    (11 results)

All 2016 2015 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Acknowledgement Compliant: 1 results,  Open Access: 1 results) Presentation (7 results) (of which Invited: 3 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] "Filobacterium rodentium gen. nov., sp. nov., a member of Filobacteriaceae fam. nov. within the phylum Bacteroidetes, and includes microaerobic filamentous bacterium isolated from rodent respiratory disease specimens"2016

    • Author(s)
      Ike F*, Sakamoto M, Ohkuma M, Kajita A, Matsushita S, Kokubo T.
    • Journal Title

      Int. J. Syst. Evol. Microbiol.

      Volume: 66 Pages: 150-157

    • DOI

      10.1099/ijsem.0.000685

    • Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
  • [Journal Article] "Evaluation of X-ray doses and their corresponding biological effects on experimental animals in cone-beam micro-CT scans (R-mCT2)"2016

    • Author(s)
      Miyahara N, Kokubo T, Hara Y, Yamada A, Koike T, Arai Y.
    • Journal Title

      Radiol. Phys. Technol.

      Volume: 9 Pages: 60-68

    • DOI

      10.1007/s12194-015-0334-1

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] "Biological measures to minimize the risk of radiotherapy-associated second cancer: a research perspective"2016

    • Author(s)
      Imaoka T, Ishii N, Kawaguchi I, Homma-Takeda S, Doi K, Daino K, Nakanishi I, Tagami K, Kokubo T, Morioka T, Hosoki A, Takabatake M, Yoshinaga S.
    • Journal Title

      Int. J. Radiat. Biol.

      Volume: 11 Pages: 1-13

    • DOI

      10.3109/09553002.2016.1152413

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] "マウスのCARバチルス感染症"2016

    • Author(s)
      池 郁生
    • Organizer
      第89回日本細菌学会総会
    • Place of Presentation
      大阪国際交流センター, 大阪府大阪市
    • Year and Date
      2016-03-23 – 2016-03-25
    • Invited
  • [Presentation] "CARバチルスに学名がつきました!"2015

    • Author(s)
      池 郁生, 坂本光央, 小久保年章.
    • Organizer
      第128回関西実験動物研究会
    • Place of Presentation
      京都大学, 京都府京都市
    • Year and Date
      2015-12-04
  • [Presentation] "免疫不全動物の飼育管理"2015

    • Author(s)
      池 郁生
    • Organizer
      第33回九州実験動物研究会総会/第35回日本実験動物技術者協会九州支部研究発表会
    • Place of Presentation
      九州大学, 福岡県福岡市
    • Year and Date
      2015-11-07
    • Invited
  • [Presentation] "CARバチルスによる結核菌コード様構造物の形成"2015

    • Author(s)
      池 郁生, 梶田亜矢子, 小久保年章.
    • Organizer
      第158回日本獣医学会学術集会
    • Place of Presentation
      北里大学獣医学部, 青森県十和田市
    • Year and Date
      2015-09-07 – 2015-09-09
  • [Presentation] "理研BRCにおける提供用免疫不全系統マウスの飼育、ならびに実験エリアでの同種マウスの維持管理"2015

    • Author(s)
      池 郁生
    • Organizer
      第158回日本獣医学会総会学術集会
    • Place of Presentation
      北里大学獣医学部, 青森県十和田市
    • Year and Date
      2015-09-07 – 2015-09-09
    • Invited
  • [Presentation] "CARバチルスの系統分類"2015

    • Author(s)
      池 郁生, 梶田亜矢子, 坂本光央, 小久保年章.
    • Organizer
      第62回日本実験動物学会総会
    • Place of Presentation
      京都テルサ, 京都府京都市
    • Year and Date
      2015-05-28 – 2015-05-30
  • [Presentation] "gBlocks-based CrisprCas9システムによるノックアウトマウス作出条件の検討"2015

    • Author(s)
      塚本智史, 伊林恵美, 和田彩子, 道川祐市, 安井孝彰, 矢野実, 鬼頭靖司, 小久保年章.
    • Organizer
      第62回日本実験動物学会総会
    • Place of Presentation
      京都テルサ, 京都府京都市
    • Year and Date
      2015-05-28 – 2015-05-30
  • [Remarks] マウス・ラットの肺炎病原体として新「科」微生物を命名 -発見以来35年ぶりに学名つく-

    • URL

      http://www.riken.jp/pr/press/2015/20151207_1/

URL: 

Published: 2017-01-06  

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