2015 Fiscal Year Research-status Report
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26670573
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
芳賀 早苗 北海道大学, 保健科学研究院, 研究員 (60706505)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小澤 岳昌 東京大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (40302806)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | 光イメージング / 細胞療法 / 細胞生存 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は移植細胞内の分子機能・細胞内環境を制御し、「移植細胞保存時の生存能の維持と向上」、「移植後の細胞生存率の向上と機能維持」を目指すものである。本年度は、昨年度から引き続き細胞生存に重要なAkt分子をターゲットとして設定し、Akt分子制御およびモニタリングプローブそれぞれの感受性・特異性の向上を試み、さらに細胞内での機能性も検討した。
１．Akt分子機能の制御プローブ：植物由来の青色光感受性タンパク質を利用してデザイン・作製され、青色光照射により分子機能を活性化させる仕組みである。本プローブは同時に2つのプローブをバランスよく導入する必要があり、これらを同等に細胞に導入する方法が昨年度からの課題となっていた。この課題を解決するために、両プローブが共に細胞内で発現する安定発現細胞株の作製を試みた。まずプローブの耐性遺伝子を変更する必要があり、異なったベクターへ遺伝子の入れ替えを行った。これを用いて安定発現株候補の細胞株（肝細胞株）を複数作製した。候補細胞株をもちいて、各プローブの導入状態および、青色光刺激によるAktの活性化を検討し、もっとも反応性のよい細胞株を選出した。さらにこの細胞株による検討で、光刺激の時間と強度がAkt活性化に大きく影響することが判明した。
２．Akt分子機能を細胞内でモニタリングするためのプローブ：初年度作製したプロトタイププローブは刺激に対する反応性が不十分であった。そのため、プローブのデザイン段階に立ち戻り、再検討を行った。DNA断片結合部位のスペーサーの調整、プローブの細胞膜への親和性向上のための修飾などの改良を加え、細胞ライセートをもちいたワンポイントアッセイにおいてプローブの活性化をある程度検出することができた。しかし、刺激直後に誘導されるAkt活性化を、生きた細胞に導入したプローブで検出するための解析方法に課題が残された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は昨年度から引き続きプローブの完成を目指した検討と細胞内でのプローブの機能性確認のための解析を進められ、研究の確実な進捗と成果が得られた。
各プローブ共に昨年度の研究結果により、その構造などに改良が必要であることが課題とされていたが、それぞれ考察を元に、まず細胞への遺伝子導入方法の再検討と（それに伴う）プローブの改良を進めた。この検討により、バランス良い遺伝子導入が可能となり、細胞内にて期待したプローブ機能を得ることが可能となった。
改変したプローブの導入により再検討を行った結果、昨年度考察されたプローブの活性化条件をさらに詳細に検討することができた。これらの成果を元に、次年度、さらに詳細な細胞内シグナルの解析および細胞傷害性に対する検討へ段階を進めることが可能となった。
他方プローブについても、前述のとおり、構造（デザイン）の再検討を行い、細胞レベルでの機能解析まで段階を進めることができた。この段階で、生細胞内で本プローブの活性化を確認するための解析方法を再検討する必要が生じた。これは、プローブ自体の非特異的な反応が、ターゲット分子の活性化シグナルと重なっている可能性が一因であると考えている。当初の計画では想定していなかった問題ではあるが、プローブの構造と機能性を解析するために解決が必須なステップである、新たな課題として次年度以降追加して検討を進める。
以上の理由から、本年度の研究の進捗状況はおおむね計画通り進展していると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も本研究は当初の計画通り１．Akt分子機能を光により制御するためのプローブ、および２．Akt分子機能を細胞内でモニタリングするためのプローブ、それぞれの確立を目指す。そのためにまずは、個々のプローブについて細胞レベルでの機能性確認中心に検討を進る。
１．Akt分子機能を光により制御するためのプローブ：これまでの検討により、効率よくプローブを発現している安定発現細胞株を作製した。今後はこの細胞をもちいて、(1)細胞内におけるAkt以降、下流経路のシグナル分子の活性化や遺伝子発現について、光制御による変化（影響）解析へと段階を進める。また、(2)光制御したターゲット分子によって、様々なストレスに対して細胞傷害抑制効果を示すか評価を始める。細胞ストレスとしては、栄養飢餓ストレス、低酸素・酸化ストレス、高血糖・脂肪化ストレス等、移植臓器の細胞が受ける可能性のあるストレスを予定している。以上の段階で検討を行い、この分子の光による活性化制御による生理機能への影響を細胞レベルで解析を進める。
２．Akt分子機能を細胞内でモニタリングするためのプローブ：本プローブはデザインの改良を行い、プローブの細胞内での機能性について検討を行っている。引き続き反応性のよいプローブを、細胞のライセートをもちいたワンポイントアッセイによって選定してゆく。
一方で新たな課題として、刺激直後に誘導されるAkt活性化を生きた細胞にて検出するための解析方法の検討があげられた。この原因を究明するとともに、解析方法の改良を検討する。また、場合によってはプローブの非特異的反応の低減の方向からのアプローチも想定している。
以上の段階がクリアされれば、これらのプローブをともに用いた細胞実験系でAkt機能を制御するとともに、Akt機能をリアルタイムにモニタリング可能か検討し、生体での使用可能性について検討を進める計画である。
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| Causes of Carryover |
本年度の研究途中で課題となった「同一細胞内に同時に2つのプローブをバランスよく導入し、発現させる方法」の技術開発に関して、一段階研究ステップをさかのぼり課題を克服するために追加検討した。そのため、本年度に予定していた検討の一部が次年度に行うこととなり、それに合わせて消耗品その他の購入なども一部次年度の使用となった。また、上記課題の検討は、初年度使用した一部試薬をそのまま使用できる過程が含まれていたため、当初の使用予定額よりも物品費がやや抑えられた。研究は当初の目的に沿って進行しており、期待する成果が得られているが、これらの理由から次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
次年度は各プローブの細胞内導入面での有効・機能性を検討するとともに、細胞内でのプローブの機能性を検討する。これらの検討は本年度より継続して解析している研究内容であり、次年度予算も使用して継続して研究を進める。本年度の研究遂行過程において、細胞内からの内因性のシグナルの関与が疑われたため、さらにこのプローブの特異性・機能性を解析する必要が生じたが、次年度予算から使用して検討を進める。「今後の研究の推進方策等」で述べた通り、本研究は当初の予定通りストレスに対するプローブの細胞傷害抑制効果の検討段階に入るため、これに関しては次年度分の助成金によって研究を進める計画である。
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