2014 Fiscal Year Research-status Report
細胞死による積極的な肝機能維持・再生制御機構の解明と臨床応用に向けた研究
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26670591
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
伊 敏 北海道大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (40292007)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
芳賀 早苗 北海道大学, 保健科学研究院, 博士研究員 (60706505)
野田 なつみ 北海道大学, 保健科学研究院, 助教 (30624358)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 再生 / 細胞死 / 昨日維持 / イメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞が積極的に関わる細胞死①アポトーシス、②ネクロプトーシス（プログラムされたネクローシス）、③オートファジーというイベントによる肝の病態・生理における役割を解析しているが、具体的には、通常の肝臓、外科的侵襲後の肝再生（細胞増殖）、虚血・再灌流後に発生する障害等における各々の形態の細胞死（アポトーシス、ネクロプローシス、オートファジー）の発現のタイミング・程度・持続と肝（特に肝傷害、肝再生）に対する病態生理的意義を研究している。本研究では、それぞれの細胞死を生体レベルで動的に解析するための光プローブを作製し、最終的に小動物モデルにおいて検討する。
我々が独自に開発した“分割ルシフェラーゼ再構成”による光イメージング理論を基盤技術として、以下に記す各種光プローブの作製を計画した。i) 細胞増殖能を示すプローブ：肝細胞の増殖能を モニタリングする目的で、リン酸化STAT3（あるいは二量体STAT3に対する光プローブ）をデザイン・作製しているが、なお改善が必要な段階である。ii) 生存能・インスリン抵抗性を示すプローブ：リン酸化Aktに対する光プローブの作製に取り掛かっている。Aktは細胞の生存に対して重要な役割を果たすため、細胞死と生存能の生体内でのバランスを評価する目的で、Akt機能評価用プローブを作製した。プローブは、酸化ストレスなどの種々の反応に対して機能しているが、マウスなど生体への応用のためには、S/N比が十分ではなく、現在改良中である。アポトーシス評価に対しては、Caspase-3活性（アポトーシス）に対する光プローブをデザイン・作製したが、十分なシグナル強度、S/N比が得られマウス実験への応用が可能と考えている。ネクロプトーシスに対する光プローブに関しては、デザインをほぼ終了し、現在作製に取り掛かっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の目的である細胞死に対する光プローブの作製に関しては、初年度に予定したほぼ全ての種類の光プローブに着手し、プロトタイプのプローブをデザイン・作製することが出来た。プローブによっては、生体で使用可能とするために、もう少し時間を要するものもあるが、caspase-3活性化プローブのように生体レベルで十分使用可能と考えられるプローブも完成しており、おおむね満足のいく研究の進捗と考えている。細胞増殖能を示すプローブに関しては、肝細胞の増殖能を示すシグナルであるSTAT3二量体化（活性化）を指標とするプローブのデザイン・作製を行った。これに関しては、十分な反応性が得られておらず、現在再度デザインしなおしている。また、生存能・インスリンシグナルを示すプローブとして、リン酸化Aktに対する光プローブのデザインおよび作製を行った。Aktは細胞の生存に対して重要な役割を果たすため、細胞死と生存能を細胞にて評価した。反応は良好であるが生体での利用にもう少し強度が必要であり、若干改善の余地が残っていると考えられた。アポトーシスによる細胞死の評価に対しては、Caspase-3活性に対する光プローブをデザイン・作製したが、これに関しては十分な反応性と高いS/N比が得られ、ほぼ完成したと考えている。細胞実験により、アポトーシス刺激薬剤、低酸素刺激などでのプローブの良好な反応と生化学的な解析結果とが一致し、生体レベルでの光プローブとして十分使用可能なものと考えられた。ネクロプトーシス評価に対するプローブは、RIP1/RIP3の二量体化に対する光プローブをデザインし作製したが、ほぼ順調に進捗し細胞実験にて評価している。オートファジーに対する光プローブは、p62/SQSTM1とKeap-1との結合を利用したプローブをデザイン・作製する予定であったが、上記STAT3活性化プローブ、Akt活性化プローブ等のデザイン・作製に若干時間を要したため、若干の遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度に作製した２つの光プローブのうち、STAT3活性化プローブに関しては、再度デザインしなおし、プローブを再構築する。また、Akt機能プローブに関しては、光プローブのリンカー部分の長さを調整するなどマイナーチェンジを行う。その後、それぞれ細胞レベルで再度評価実験を行う。アポトーシスに対するプローブ（カスパーゼ３活性）に関しては、十分に使用可能であり、マウス実験に移行する。ネクロプトーシス評価に対する光プローブを作製する。RIP1/RIP3の二量体化（あるいはRIP1/RIP3/MLKLの三量体化となる可能性もあり）に対するプローブを作製中し、今後細胞実験にて評価する。iv) オートファジーに対する光プローブを作製する。p62/SQSTM1は、オートファゴソーム膜上に発現しオートファジーのマーカーとなるが、他方Nrf-2活性を制御するためにKeap-1と相互作用する。これを利用して、光プローブをデザインする。あるいは、p62/SQSTM1遺伝子のレポーターを作成して、その発現評価を行う。
１）細胞実験による光プローブの評価を行う。細胞（非腫瘍性肝細胞株：AML12、TIB-73）を用いて、作製したプローブの評価を細胞レベルにて行う。マウス肝細胞株に対してアポトーシス、ネクロプトーシス、オートファジーを誘導する物質・薬剤として、それぞれFasリガンド、ツニカマイシン、ラパマイシンをもちいる。刺激に対して、用量依存的にかつ特異的にプローブからシグナルが発現するか、また生体イメージングに使用可能な十分なS/N比を得られるかどうかを確認する。十分でない場合には、光プローブを再度作製し、生体レベルでのイメージングに使用可能なS/N比を示す光プローブの作製を目指す。また、シグナルの特異性に関しても評価する。
２）生体イメージングに使用可能であることを確認した光プローブに対して、それぞれアデノウイルス等のベクターに組み込んで、マウスを用いた生体イメージング実験を行う。
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| Causes of Carryover |
初年度に作製した２つの光プローブのうち、STAT3活性化プローブに関しては、十分な反応とシグナルが得られず、プローブを再構築する必要が生じた。Akt機能プローブに関しては、反応強度を高めるために基質と光プローブの間のリンカー部分の長さを調整するなどの調整を行う必要が生じた。これらは十分に克服可能な課題であるが、改良・改善には若干の時間を要する見込みである。それにともない、初年度に行う予定であったネクロプトーシス、オートファジーに対する光プローブのデザイン・作製を次年度に行う予定となった。ネクロプトーシスに対するRIP1/RIP3結合により活性化する光プローブは、次年度も細胞実験を継続し評価する。p62/SQSTM1とKeap-1との結合により活性化する光プローブ、62/SQSTM1遺伝子のレポーター作製は、現在作製中であり次年度も継続する。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
本年度繰り越された予算は、以下に記載した研究を推進するために、分子生物学的解析・培養関連試薬、ディスポーザブル等を購入・使用する。次の段階の実験に速やかに移行するために、次年度（H27年度）夏までに使用する予定である。STAT3プローブの再デザイン・再構築のために、またAkt機能プローブの微調整ために、分子生物学的試薬、ディスポーザブル等を購入する。その後細胞実験によりシグナル強度、刺激に対する特異性を再度検討するため、細胞培養関連試薬、刺激用薬剤、ディスポーザブルの購入費用として使用する。また、ネクロプトーシスに対するRIP1/RIP3の二量体化に対するプローブの細胞における評価実験に関しては、分子生物学的試薬、細胞培養試薬、ディスポーザブル等を購入し、オートファジーに対するプローブデザイン・作製に関しても、分子生物学的試薬等を購入する。
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[Journal Article] Gadd34 regulates liver regeneration in hepatic steatosis.2015
Author(s)
Yuka Inaba, Tomoko Furutani, Kumi Kimura, Hitoshi Watanabe, Sanae Haga, Yoshiaki Kido, Michihiro Matsumoto, Yasuhiko Yamamoto, Kenichi Harada, Shuichi Kaneko, Seiichi Oyadomari, Michitaka Ozaki, Masato Kasuga, Hiroshi Inoue.
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Journal Title
Hepatology
Volume: 61
Pages: 1343-1356
Peer Reviewed
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[Journal Article] p62/SQSTM1 plays a protective role in oxidative injury of steatotic liver in a mouse hepatectomy model.2014
Author(s)
Sanae Haga, Takeaki Ozawa, Yuma Yamada, Naoki Morita, Izuru Nagashima, Hiroshi Inoue, Yuka Inaba, Natsumi Noda, Riichiro Abe, Kazuo Umezawa, Michitaka Ozaki.
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Journal Title
Antioxid Redox Signal
Volume: 21
Pages: 2515-2530
Peer Reviewed
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[Journal Article] Anoikis induction and inhibition of peritoneal metastasis of pancreatic cancer cells by a nuclear factor-kappa B inhibitor, (-)-DHMEQ.2014
Author(s)
Masanori Sato, Kazuaki Nakanishi, Sanae Haga, Masato Fujiyoshi, Motoi Baba, Kazuhiro Mino, Yimin, Haruki Niwa, Hideki Yokoo, Kazuo Umezawa, Yoshihiro Ohmiya, Toshiya Kamiyama, Satoru Todo, Akinobu Taketomi, Michitaka Ozaki.
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Journal Title
Oncology Research
Volume: 21
Pages: 333-343
Peer Reviewed
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