2014 Fiscal Year Research-status Report
無血清・無フィーダ培養系でのヒトｉＰＳ樹立と胚様体培養法を用いた顎骨・歯胚誘導
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26670865
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
岡本 哲治 広島大学, 医歯薬保健学研究院, 教授 (00169153)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 無血清培養 / ヒトiPS細胞 / 軟骨・骨形成 / 未分化性 / 多分化能 / ３胚葉分化 / センダイウイルスベクター / 無血清培地（hESF9） |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度においては、フィーダー細胞を用いずに無血清培地(hESF9)で、健常人歯髄細胞(DPC)、健常人末梢リンパ球(PBMC)及び頭蓋顎顔面骨・軟骨・歯胚形成異常を伴う鎖骨頭蓋異形成症(CCD)患者由来DPCおよびPBMC由来ヒトiPS細胞(iPSC)を樹立し、各細胞の特性解析を行った。DPC、PBMCはそれぞれRD6F及びRD6F+IL２で初代培養し、初期化遺伝子の導入は、ゲノムDNAへランダムな遺伝子挿入が起こらないセンダイウイルスベクター（SeVdp (KOSM)を用いて行った。DPCからのiPSCの樹立には細胞接着因子としてフィブロネクチンが最適であったが、PBMCにはラミニンが最適であった。各hiPSCではSeVdpの残存は認めず、完全に除去されていることが明らかとなった。
健常人及び疾患由来のいずれのiPSCもin vitroにおいて未分化マーカー遺伝子(Oct3/4, Nanog, Sox2, Rex1)および蛋白(Oct3/4, Nanog, SSEA4, Tra1-81)をRT-PCR法および蛍光免疫染色法にて発現していた。また、多分化能をembryo body 形成法にて分化を誘導したところ、Nestin, Microtubule-associated protein 2, α-smooth muscle actin, Alpha-fetoprotein遺伝子および蛋白(Nestin, MAP2, αSMA, AFP)を発現し、３胚葉への分化能を示した。
マウス皮下への移植によるテラトーマ形成能を検討したところ、健常人由来iPSCでは３胚葉への分化を示し、その組織像は正常であった。しかしCCD-iPSC由来テラトーマも３胚葉への分化を示したものの、CCD-hiPSC由来テラトーマにおける軟骨組織は、軟骨基質が疎であり疾患の特徴を反映した組織像を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. SeVdp を用いて、フィーダー細胞を用いることなく無血清条件下にDPC-hiPSC、CCD-hiPSC及び、NS-hiPSCの樹立に成功した。2. DPC-hiPSC、CCD-hiPSC及び、NS-hiPSCはそれぞれ未分化性と多分化能を有していた。3.ALP陽性コロニーを指標に誘導効率を検討したところ、無血清条件ではMOI=3で平均0.30%、MOI=6で0.31%、MOI=9で0.25%を示した。4. 遺伝子発現にて各hiPSCではSeVdpの残存は認めなかったことから、導入に使用したSeVdpは完全に除去されていることが明らかとなった。5. STR解析の結果、DPC-iPSC、CCD-iPSCおよび、NS-iPSC はそれぞれDPC、CCD-DPC及び、NS-DPC由来であることが同定された。6. DPC-hiPSC、CCD-hiPSC及び、NS-hiPSC由来teratomaは、3胚葉への分化能を示した。7. CCD-hiPSC及びNS-hiPSC由来teratomaにおけるの軟骨組織は、軟骨基質が疎であり疾患の特徴を反映した組織像を認めた。
以上のように、初年度の予定を順調に達成することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
各種分化誘導因子を用いて歯胚細胞系への分化誘導法を検討するとともに、各分化誘導因子の最適濃度を探索し、効率的な分化誘導法の開発を検討する。さらに、CCDの原因遺伝子産物Runx2は軟骨細胞分化、歯骨細胞分化、歯の発生に重要な因子であるため、骨・軟骨細胞系列への分化誘導を行い、健常人由来iPS細胞と比較検討を行うことで、発症メカニズムの解明ならびに詳細な機能解析を行うことが可能であると考える。さらに、同様に顎骨や歯胚形成異常を伴う他の遺伝子疾患患者由来iPS細胞を樹立し同様の検討を行う。
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| Causes of Carryover |
２６年度に予定していた、旅費及び人件費の支出がなかったため使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
今年度は研究計画を達成するため、特に大学院生の研究補助などの人件費を計上する。
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Research Products
(10 results)
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[Journal Article] Comparison of the prognosis of bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw caused by oral and intravenous bisphosphonates.2015
Author(s)
Shintani T, Hayashido Y, Mukasa H, Akagi E, Hoshino M, Ishida Y, Hamana T, Okamoto K, Kanda T, Koizumi K, Yoshioka Y, Tani R, Toratani S, Okamoto T.
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Journal Title
Int J Oral Maxillofac Surg.
Volume: pii: S0901-5027(15)
Pages: 125-133
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Reprogramming efficiencies of hiPS cells with various virus vectors in serum- and feeder-free culture conditions.2014
Author(s)
Eri AKAGI, Sachiko YAMASAKI, Atsuko HAMADA, Yuki TAGUCHI, Hanae MUKASA, Manami OHTAKA, Ken NISHIMURA, Mahito NAKANISHI, and Tetsuji OKAMOTO
Organizer
World Congress of Society for In Vitro Biology,
Place of Presentation
Hyatt Regency Savannah, Savannah, Georgia, USA
Year and Date
2014-05-30 – 2014-06-04
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[Presentation] Generation and maintenance of human induced pluripotent stem cells in serum- and feeder-free culture using Sendai virus vectors.2014
Author(s)
HAMADA, Sachiko YAMASAKI, Eri AKAGI, Manami OHTAKA, Ken NISHIMURA, Mahito NAKANISHI, Tetsuji OKAMOTO
Organizer
World Congress of Society for In Vitro Biology,
Place of Presentation
Hyatt Regency Savannah, Savannah, Georgia, USA
Year and Date
2014-05-30 – 2014-06-04
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