2015 Fiscal Year Annual Research Report
高度に機能化した分子酸素計を用いた細胞内酸素濃度計測およびイメージング
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26702011
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
吉原 利忠 群馬大学, 大学院理工学府, 助教 (10375561)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | レシオ / 蛍光 / りん光 / 酸素 / イリジウム錯体 / 細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，細胞内の酸素濃度および濃度分布を高感度，非侵襲的にリアルタイムイメージング，計測するための蛍光・りん光同時発光型分子酸素計を開発することである。本年度は，細胞親和性を向上させるために，青色蛍光を示すクマリン系蛍光色素であるC343と，深赤色りん光を示すカチオン性イリジウム錯体である(btq)2Ir(phen)をアルギニン残基数8および12のオリゴアルギニンリンカーで結合させたC343-Arg8-BTQphen，C343-Arg12-BTQphenの合成を行った。開発したC343-Arg8-BTQphen，C343-Arg12-BTQphenは，アセトニトリル中においてC343由来の蛍光と(btq)2Ir(phen)由来のりん光が観測された。また，溶液中の酸素分圧をマスフローメーターで0-160mmHgの範囲で変化させたところ，C343の蛍光強度は一定の値を示したのに対して，(btq)2Ir(phen)のりん光強度は，酸素分圧の増加ともに減少を示した。
21％酸素条件下で培養したHeLa細胞にC343-Pro8-BTQphen（平成26年度合成），C343-Arg8-BTQphen溶液を最終濃度5μMで添加し，6時間培養後，蛍光顕微鏡で観察をおこなったところ，C343-Arg8-BTQphenの発光輝度は，C343-Pro8-BTQphenに比べて10倍程度高い値を示した。これは，開発したC343-Arg8-BTQphenが高い細胞親和性を有するためである。また，C343に由来する蛍光は，培養酸素濃度に依存しないのに対して，(btq)2Ir(phen)に由来するりん光は，2.5％酸素条件下において，21％酸素条件下よりも増加し，レシオ型酸素プローブ分子としてより有効に機能することが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は，細胞内の酸素濃度および濃度分布を高感度，非侵襲的にリアルタイムイメージング，計測するための蛍光・りん光同時発光型分子酸素計を開発することである。本年度は，蛍光団として青色蛍光を示すクマリン色素（C343）とりん光団として深赤色りん光を示すイリジウム錯体（(btq)2Ir(phen)）をアルギニンリンカーで結合させたC343-Arg8-BTQphen，C343-Arg12-BTQphenの合成を行なった。これらの化合物は405nm光励起によって，アセトニトリル中において蛍光とりん光が同時に観測された。また，系中の酸素分圧を変化させて発光スペクトル測定を行ったところ，C343由来の蛍光は酸素分圧に対して一定強度を示したのに対して，BTP由来のりん光は，酸素分圧の増加に伴い減少した。C343-Arg8-BTQphen，C343-Arg12-BTQphen溶液をHeLa細胞の培地に添加し，蛍光顕微鏡で観測した結果，細胞内から蛍光とりん光が観測され，さらに，りん光強度は低酸素培養条件で増加した。また，C343-Arg8-BTQphenにおいては，市販の蛍光プレートリーダーを用いて，蛍光とりん光の強度比が測定できることが明らかとなった。
以上の結果より，C343-Arg8-BTQphenは，蛍光とりん光のレシオを利用することにより，溶液，脂質膜，細胞中の酸素濃度を定量的に解析できるプローブ分子であることがわかり，本年度の目標に到達している。現在，知的財産権の確保および論文投稿準備を行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度開発したC343-Arg8-BTQphen，C343-Arg12-BTQphenは，生細胞内において酸素濃度に依存して，蛍光に対するりん光強度比が変化することが確認でき，また，これまで研究代表者が開発してきた化合物と比較して細胞親和性が著しく向上した。今後は，合成したレシオ型酸素プローブについてHeLa細胞だけでなく，他の細胞を用いて同様な実験を行い，レシオ型酸素プローブ分子として汎用的に使用可能か検討する。また，レシオ型分子酸素計の細胞内移行機構や細胞内局在を明らかにする。さらに，アルギニンリンカーに対して，他の蛍光団やりん光団を結合させたレシオ型酸素プローブ分子も合成する。例えば，緑色蛍光を示すフルオレセインやニトロベンゾフラザン類をを用いることで，より長波長励起が可能となり細胞への光毒性を低下できることが期待される。
平成27年度は目的化合物の合成が予想以上に進展したため，試薬，消耗品費が予定よりも少なくなり，その差額を平成28年度の試薬，消耗品費に充てる。平成28年度は，目的化合物を大量（数百mgから1g程度）に分離・精製するために中圧分取精製装置を備品として購入する。また，新しいレシオ型酸素プローブを開発するための試薬や，種々の細胞で評価するための試薬，溶媒，細胞培養のためのプラスチック類を消耗品費として研究費を使用する。また，研究成果発表のための旅費として研究費を使用する。
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| Causes of Carryover |
平成27年度は目的化合物の合成が予想以上に進展したため，試薬，消耗品費が予定よりも少なくなり，その差額を平成28年度の試薬，消耗品費に充てる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
平成28年度は，目的化合物を大量（数百mgから1g程度）に分離・精製するために中圧分取精製装置を備品として購入する。また，新しいレシオ型酸素プローブを開発するための試薬や，種々の細胞で評価するための試薬，溶媒，細胞培養のためのプラスチック類を消耗品費として研究費を使用する。また，研究成果発表のための旅費として研究費を使用する。
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