2015 Fiscal Year Annual Research Report
膜タンパク質の分子機構解明に資する新規赤外分光計測法の開発
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26708002
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| Research Institution | Institute for Molecular Science |
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Principal Investigator |
古谷 祐詞 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 准教授 (80432285)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 赤外分光法 / 生物物理 / 膜タンパク質 / イオンチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）イオン・基質透過経路でのイオン・基質との相互作用解析
本年度は、ほ乳動物由来のカリウムチャネルタンパク質であるTWIK-1について、培養細胞で発現したタンパク質がチャネル活性を保持しているのかを確かめるための実験系を構築した。具体的には、内部にプロトン感受性蛍光蛍光色素ACMAを含むリポソームにTWIK-1を再構成して、K+イオンの流出に伴うプロトンの流入による蛍光強度の減少からチャネル活性を計測する実験系となる。先行研究を参考にしながら、TWIK-1のカリウムチャネル活性が保持されていることを確認した。視物質ロドプシンはGPCRの一種であり、発色団レチナールが外れたアポタンパク質（オプシン）はGPCRの良いモデル系となり得る。オプシンに対する様々な化合物の結合について、全反射赤外分光計測を用いた解析を行った。また、カリウムチャネルKcsAについては様々なアルカリ金属との結合に誘起される差スペクトルを解析した結果に関する論文を発表した（Y. Furutani et al. Biophysics and Physicobiology, 2015）。
２）急速溶液交換法によるイオン・基質の結合解離に伴う構造ダイナミクスの解明。
3回反射型の全反射赤外分光用結晶において、溶液の交換速度が向上するかどうかを検討した。直径が4 mmの9回反射型に比べて、直径が2 mmの3回反射型は交換する溶液の量が少ないので、より高速に交換できる可能性があると思われた。流路を規定するテフロンパーツの製作などを行い、最適な計測条件を検討したが、溶液の交換速度は数十ミリ秒程度とそれほど変化が見られなかった。しかしながら、交換する液量を120 μLから320μLに増加させると、立ち上がり後の溶液濃度が安定することが分かった。交換後の溶液組成を一定に保つことは、タンパク質へのリガンドやイオン等の結合を時間分解計測するのに重要なことであるため、参考になる知見が得られたものと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
カリウムチャネルのアルカリ金属イオンとの相互作用解析について論文発表を行った（Y. Furutani et al. Biophys. Physicobiol. 2015）。急速溶液交換装置による実験系の最適化も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、（１）の研究テーマに関連して、ほ乳動物のカリウムイオンチャネルであるTWIK-1において、カリウム選択性が弱くなっている構造的要因を明らかにするため、カリウムイオンとその他のアルカリ金属イオンとでイオン選択フィルターとの相互作用にどのような差異があるのかを全反射赤外分光計測で解析する。特に、イオンチャネル活性をリポソームとプロトン感受性蛍光色素ACMAを使った実験系で確認し、その実験条件に近い脂質組成での実験も行う。GPCRの一種であるロドプシン類、メリビオース輸送タンパク質に対する全反射赤外分光計測を行い、タンパク質と基質との相互作用を解析し、機能発現との関連を明らかにすることを目指して、研究を進める。
また、（２）の研究テーマに関連して、交換する溶液の量が少ない3回反射型の全反射光学実験系での実験の最適な計測条件の構築を前年度から引き続いて行う。顕微赤外分光計測の計測系の構築に必要なピエゾ駆動のZ軸試料台を導入し、表面増強赤外分光計測などの実験条件の検討を行う。
さらに、（１）および（２）の研究テーマでの研究対象となるイオンチャネルタンパク質の活性を確認するため、平面脂質膜法によるシングルチャネル電流計測系の構築や評価を行う。
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| Causes of Carryover |
当初、博士研究員の雇用を計画していたが、研究計画を見直し、試料調製に関わる技術支援員を雇用することが最適であると考え、平成26年3月から1名の技術支援員を雇用した。しかしながら、当該技術支援員が平成27年12月で退職したため、雇用費が予定より少なくなった。また、赤外分光測定に使用する試薬、膜タンパク質の調製に必要となる試薬や培地などを節約した。以上の理由により、今年度に必要な研究費を当初の予定よりも少なくすることができたため。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
新たな技術支援員の雇用および試料調製に必要な試薬、赤外分光測定に必要な光学部品、顕微赤外分光計測で用いるピエゾ駆動のZ軸試料台等で使用する計画である。
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