2014 Fiscal Year Annual Research Report
多能性幹細胞を用いた三次元精巣組織の再構築による完全体外精子形成法の開発
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26713012
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
佐藤 卓也 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特任助教 (70599505)
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| Project Period (FY) |
2014-04-01 – 2018-03-31
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| Keywords | 精子形成 / 器官培養 / 精巣 / セルトリ細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、精子形成には精巣組織に特有のチューブ構造をもった3次元構造が重要であるという観点に基づき、器官培養法によるin vitro精子形成法を開発してきた。そして、精子幹細胞から妊孕能を有する機能的な精子へ分化誘導する方法の開発に成功している。この実験系における問題は、マウス個体から採取された組織に依存した方法であるという点である。したがって、本研究課題では、多能性幹細胞(ES細胞)からin vitroで精巣細胞を分化誘導し、立体的な精巣組織を構築する方法の開発を行う。そして最終的には、その再構築精巣を器官培養し、精子幹細胞から妊孕能のある精子産生までの全ての過程をin vitroで再現可能な方法を構築することを最終目的とする。
初年度は、研究を進めるために必要なレポーターマウスの導入や、ES細胞を培養するための環境作りを行った。レポーターマウスとして、Dhh-creあるいはAmh-creマウスとCAG-floxed Neo-GFPマウスと交配したマウスを使用することとした。DhhやAmhは、主にセルトリ細胞で発現する遺伝子であり、これらのマウスは、セルトリ細胞がラベルされることが報告されている。さらに、同様にセルトリ細胞でGFPを発現するSox9-GFPマウスを入手した。これらのマウスの胚盤胞からES細胞の樹立を行った。
一方で、精子幹細胞の遺伝子改変は、その効率が低く大変困難な技術となっている。精子幹細胞の効率的な遺伝子改変技術が開発されれば、精子形成メカニズムの解明や、in vitroでの精子形成システムの開発にも有用である。そこで、TALENやCRISPR/Cas9システムといった近年注目されるゲノム編集技術が、精子幹細胞の遺伝子改変においても有効かどうか調べた。その結果、ゲノム編集技術により、高効率でノックインが可能になることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
レポーターマウスとして導入したDhh-creとAmh-creマウスは、当研究室で発現パターンを解析したところ、残念ながら過去の報告通りではなかった。原因は不明であるが、飼育中に何らかの問題が生じ、トランスジーンの発現が抑制されたものと思われる。したがって、本実験のためには使用できなくなってしまった。そのため、研究の進展が遅れる結果となってしまった。その後、入手したSox9-GFPマウスから樹立したES細胞を使い、今後研究を進めることとした。
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| Strategy for Future Research Activity |
Sox9-GFPのES細胞を樹立することができたので、今後、このES細胞を使用し分化誘導実験を本格的に進めていく予定である。具体的には、近年、複数報告されている中間中胚葉を経由した腎臓細胞の分化誘導法(精巣細胞は細胞の起源が近い)をもとに培養条件を種々検討していく計画である。また、GFPを発現する細胞が現れた場合、その細胞と精巣細胞とを混合し、精巣を再構築することで、GFP陽性細胞が精巣組織へ寄与するかどうかを評価する。
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| Causes of Carryover |
研究に使用予定するために購入したマウスの表現型が想定と異なっており、別のマウスを使用を検討するなど、実験計画を見直さざるを得なくなった。そのため研究のに遅れが生じ、研究費に残額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
精巣細胞の分化誘導条件の検討を本格的に進める予定ある。そのために、網羅的に培養液・成長因子などを加え調べていくので、研究費の大部分はそれらの消耗品にあてる予定である。
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[Journal Article] Offspring production with sperm grown in vito from cryopreserved testis tissues2014
Author(s)
Yokonishi, T. Sato, T. Komeya, M. Katagiri, K. Kubota, Y. Nakabayashi, K. Hata, K. Inoue, K. Ogonuki, N. Ogura, A. Ogawa, T.
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Journal Title
Nature communications
Volume: 5
Pages: 4320
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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