直接的分化誘導法による網膜視細胞作製技術の応用-変性過程のin vitro解析

2014 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 26830037
• Research Institution: National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities
• Principal Investigator: 小牟田 縁 国立障害者リハビリテーションセンター(研究所), 研究所 感覚機能系障害研究部, 流動研究員 (60566850)
• Project Period (FY): 2014-04-01 – 2017-03-31
• Keywords: 分化誘導 / 視細胞

Outline of Annual Research Achievements

市販の正常ヒト皮膚由来の線維芽細胞（Promocell社）に対し、RAX、CRX、NEUROD、OTX2の4つの遺伝子をレトロウィルスの感染によって導入し、視細胞様細胞を作製した。コントロール実験には、GFP遺伝子をレトロウィルスによって導入した細胞群を使用した。アポトーシス誘導試薬（一般によく使用されているActinomycin、Camptothecin、Cyclohexamide、Dexamethasone、Etoposide）、小胞体ストレス誘導試薬（Tunicamycin、Thapsigargin）、オートファジー誘導試薬（Rapamycine）を使用した。1週間分化誘導培地で培養した後、PBSで洗浄し、各濃度の試薬を添加した培地で16時間培養した。その後、細胞を４％パラホルム固定液で固定し、抗active caspase3抗体で免疫染色しアポトーシスを観察した。
コントロール細胞と視細胞様細胞で比較すると、Actinomycin、Camptothecin、Cyclohexamideでは高濃度で両者ともアポトーシスが起こることが確認されたが、視細胞様細胞ではより低濃度でもアポトーシスが起きていた。Etoposide、Thapsigargin、Tunicamycinでは視細胞様細胞にのみアポトーシスが確認された。一方、Dexamethasone、Rapamycineではアポトーシスに関しての顕著な差は確認されなかった。これらの結果より、4因子を導入して視細胞様細胞に分化させた細胞はアポトーシス誘導に対し感受性が高まり、また小胞体ストレスからアポトーシスを起こす機序が形成されていることが示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

市販の正常ヒト皮膚線維芽細胞で分化誘導し、ERストレス、アポトーシス、オートファジー誘導を行い、アポトーシスを確認する実験を行った。一連の実験のための準備を行い、最終的に分化誘導した視細胞様細胞でのアポトーシスを確認することができ、分化誘導しなかったものと比較しても差が確認された。
RP患者の皮膚線維芽細胞より分化誘導・遺伝子発現解析を行わなかったが、これは患者由来皮膚線維芽細胞の増殖が十分でなかったためである。

Strategy for Future Research Activity

市販の皮膚線維芽細胞を使用し、濃度や培養時間などのより詳細な検討を行い、各数値を決定する。今年度の結果を基準として、患者由来皮膚細胞から視細胞様細胞を作成し、各試薬への感受性の違いがあるかを確認する。さらに他の有用な試薬があれば同様のテストを行い、これらの阻害剤の機序を考慮し、細胞の変性機構の仮説を立て、その検証を行う。
患者由来皮膚線維芽細胞の増殖には個人差異があり、実験に十分な細胞数に増殖しにくい場合もあったため、このことは課題となった。現在は最低限の実験ができる程度には増殖しているため、遺伝子解析を行う予定である。今後、線維芽細胞を十分増殖させる、もしくは採集した部位以外の皮膚線維芽細胞などを含め、増殖しやすい細胞を使用することも想定している。

Causes of Carryover

実験の日程上の都合で、当初参加予定であった学会に参加しなかったため。
当該年度中に患者由来細胞が十分に増殖しなかったので、分化誘導した細胞の網羅的遺伝子解析を行わなかったため。

Expenditure Plan for Carryover Budget

成果をまとめ、学会に参加し積極的な発表と情報交換を行う。
できなかった網羅的遺伝子解析を行いたい。